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geek23木虫 (小有名气)
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[求助]
WB检测磷酸化蛋白
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| 各位大侠,有用过CST的磷酸化抗体检测磷酸化蛋白的吗?请问在整个提蛋白以及WB过程中有什么注意事项?小女最近做了几个抗体都没有条带.急~~~ |
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zplipeng
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20楼2011-12-12 19:52:52
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21楼2011-12-12 20:00:38
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送鲜花一朵 |
问几个比较细的问题： 1、楼主提取的细胞是贴壁的吗？是先消化再加裂解液还是直接向培养皿中加裂解液？我尝试了一下在培养皿（10cm）中加裂解液（300ul），因为不能加的少（盖不过来），最后提取的蛋白只有3mg/ml。而我先收集细胞后再加的裂解液，细胞浓度可以达到40mg/ml。但我担心收集细胞以及洗涤，冰冻裂解（液氮冰冻三次，因为没有超声波仪器）的过程会导致降解。可以说明您具体的提取方法吗？最好有详细的步骤 2、做蛋白磷酸化的PAGE时，楼主上样多少ul？每孔多少蛋白？我一开始做的时候一般每孔上样20uL（10uL蛋白+10uL Loadingbuffer），因为提取的蛋白浓度几乎为30-40ug/ul，所以跑出来的蛋白条带往往连在一起。导致内参检测成一条线。 3、楼主提取的蛋白现用嘛？还是在-80度保存？ 4、楼主转膜的条件是什么？ 谢谢啦。 |
23楼2011-12-13 22:40:05
zplipeng
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26楼2011-12-14 23:37:02
zplipeng
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28楼2011-12-26 23:10:14