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[交流]
【求助/交流】蛋白降解严重，求救！
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先谢谢大家看我的贴子，也请大家耐心的看完，帮助我解决问题，非常感谢！ 我现在做的是假病毒的原核表达。假病毒会把目的基因包裹在里面，形成病毒蛋白颗粒。 我的实验步骤是这样的： 1.构建好假病毒表达载体，即把目的基因与假病毒序列及pET28a连在一起，转化BL21 2.IPTG诱导表达。 3.离心收集菌体，加入超声buffer（加入溶菌酶及PMSF），37摄氏度摇1h 4.超声破碎，工作5s，间歇5s，时间为1min，做10次 5.离心30min，收集上清 6.超声上清用RNase和DNase双酶消化1h，加入0.5M的EDTA把酶灭活 这样得到的超声上清含有我所需要的病毒蛋白颗粒 问题是： 一开始的时候诱导表达的浓度都很高，要稀释几个数量级才能用。但是随着时间推移，一直做下来，诱导表达量变得很低，双酶消化后检查病毒颗粒的浓度，也越来越低，三四个月下来，起码降了三个数量级。 请问： 我的实验步骤中有没有要注意的地方，或做错的地方？ 蛋白降解这么严重的原因有哪些？ 我该如何防止？ 谢谢！  |
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