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xwsooo

银虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】提取的DNA降解了??

本人最近在提取人外周血DNA(手工NAI法提取)时,电泳后发现DNA条带好多呈弥散状,貌似降解了(如下图所示),一直不得改善,请各位支个招吧,真愁人呀~~~






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★ ★
xwsooo(金币+1): 灰常感谢 2011-03-03 20:48:19
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-03-03 20:55:25
marker 是10kb的或者更小?

smear的有可能是提取的时候操作的问题或者样品不新鲜了,毕竟好多都是完整的一条带。

如果下一步用来PCR的话,只要纯度够,完全没问题。

你的电泳液是不是很久没换了?
2楼2011-03-03 20:13:00
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xwsooo

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-03 20:13:00:
marker 是10kb的或者更小?

smear的有可能是提取的时候操作的问题或者样品不新鲜了,毕竟好多都是完整的一条带。

如果下一步用来PCR的话,只要纯度够,完全没问题。

你的电泳液是不是很久没换了?

电泳液是经常换的~,marker 是100bp的(即是100bp-1500bp范围共11个条带),样品是采血后8天左右的~

长成弥散这样了,还可以PCR,那么PCR结果 又该如何分析???
3楼2011-03-03 20:51:10
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引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-03 20:51:10:
电泳液是经常换的~,marker 是100bp的(即是100bp-1500bp范围共11个条带),样品是采血后8天左右的~

长成弥散这样了,还可以PCR,那么PCR结果 又该如何分析???

PCR结果的分析? 我咋知道你扩增什么东东,扩增这个东东的目的是啥啊,呵呵。
4楼2011-03-03 21:37:31
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xwsooo

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-03 21:37:31:
PCR结果的分析? 我咋知道你扩增什么东东,扩增这个东东的目的是啥啊,呵呵。

额,我的意思是如果模板不好,那么PCR的结果会受影响吧,到时候分析原因就不好分析了吧~~~
5楼2011-03-03 22:08:57
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xwsooo(金币+1): 2011-04-25 19:51:36
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-03 22:08:57:
额,我的意思是如果模板不好,那么PCR的结果会受影响吧,到时候分析原因就不好分析了吧~~~

如果目的片段不是很大的话,相信你的DNA质量足够了。试一把再说,呵呵
6楼2011-03-03 22:22:39
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wqj1988926

金虫 (正式写手)


xwsooo(金币+1): 2011-03-04 09:29:55
配胶的和电泳缓冲液更换新的,可以试着提高电压以减小弥散
7楼2011-03-03 22:44:28
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xwsooo

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by wqj1988926 at 2011-03-03 22:44:28:
配胶的和电泳缓冲液更换新的,可以试着提高电压以减小弥散

嗯,胶是刚制备完的,电泳缓冲液也是经常换呢的,电压到了120V了。
8楼2011-03-04 09:31:11
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xwsooo

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-03 22:22:39:
如果目的片段不是很大的话,相信你的DNA质量足够了。试一把再说,呵呵

我挑了相对比较好的拿去跑,结果不稳定,不同标本做的效果差别大~~~
9楼2011-03-04 09:32:17
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liurtxm

铜虫 (小有名气)


继续努力

★ ★ ★
看天(金币+3): 鼓励分享 新人 2011-03-04 18:47:15
DNA至少也要提到这个程度吧。图片用ACDsee Pro 修修,呵呵

10楼2011-03-04 10:23:59
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liurtxm

铜虫 (小有名气)


参考


xwsooo(金币+1): 灰常感谢~~~ 2011-03-04 18:05:01
看天(金币+1): 热心 2011-03-04 18:47:34
【操作步骤】(易生物 参考)

1、取新鲜抗凝血100μl置Eppendorf(Ep)管中,离心10000rpm×1min。

2、弃上清,加ddH2O200μl,摇匀20sec。

3、加6mol/LNaI200μl,缓慢倒置摇匀20sec。

4、于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400μl,摇匀20sec,离心12000rpm×12min

5、吸取上层水相360μl置一新Ep管中,加纯异丙醇200μl,摇匀20sec

6、室温放置15min,离心14000rpm×12min

7、小心弃去上清,再加37%异丙醇1ml(勿摇动),离心14000rpm×12min

8、小心弃去异丙醇,晾干。

9、加50μlTE缓冲液溶解DNA,以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20℃保存。

【注意事项】

1、标本必须新鲜,提取前细胞应保持完整。所用Ep管,吸嘴等器物及ddH2O、试剂等应高压灭菌,操作尽量在4℃以下进行。

2、混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动作剧烈。

3、弃异丙醇时动作应轻,切忌甩干,以免DNA丢失。

4、0.54~1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA、rRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀;在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去,所以常规需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。
11楼2011-03-04 10:31:52
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xwsooo

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by liurtxm at 2011-03-04 10:31:52:
【操作步骤】(易生物 参考)

1、取新鲜抗凝血100μl置Eppendorf(Ep)管中,离心10000rpm×1min。

2、弃上清,加ddH2O200μl,摇匀20sec。

3、加6mol/LNaI200μl,缓慢倒置摇匀20sec。

4、于管内加氯 ...

我的方法步骤和上面的略微有所不同,不知道晾干多久?
12楼2011-03-04 18:10:05
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liurtxm

铜虫 (小有名气)


xwsooo(金币+1): 2011-04-25 19:51:54
放在超净工作台里,吹风,看见粉末状就差不多了,加无菌水。
13楼2011-03-23 17:35:15
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xwsooo

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by liurtxm at 2011-03-23 17:35:15:
放在超净工作台里,吹风,看见粉末状就差不多了,加无菌水。

啊,我每次都没有看见粉末状啊。。。
14楼2011-03-23 20:21:48
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xwsooo

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by liurtxm at 2011-03-04 10:23:59:
DNA至少也要提到这个程度吧。图片用ACDsee Pro 修修,呵呵

请问,marker右边的两个图,呈弥散的,是降解么,我感觉是不是量多或浓度大导致的弥散??
15楼2011-03-24 12:50:17
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左岸的雅各宾

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你好,我现在也在做电泳,所提的DNA也总是降解,无意中看到你这个帖子。想问你最后怎么处理的呢?
16楼2012-12-05 21:10:29
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wudi2017

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by 左岸的雅各宾 at 2012-12-05 21:10:29
你好,我现在也在做电泳,所提的DNA也总是降解,无意中看到你这个帖子。想问你最后怎么处理的呢?

我也是,提土壤中的,一直有拖带,操作已经精细到不能再精细了。。
17楼2017-08-04 22:12:42
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