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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】提取的DNA降解了？？

本人最近在提取人外周血DNA（手工NAI法提取）时，电泳后发现DNA条带好多呈弥散状，貌似降解了（如下图所示），一直不得改善，请各位支个招吧，真愁人呀~~~
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1楼 2011-03-03 20:04:02
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
xwsooo(金币+1): 灰常感谢 2011-03-03 20:48:19
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-03-03 20:55:25
marker 是10kb的或者更小？

smear的有可能是提取的时候操作的问题或者样品不新鲜了，毕竟好多都是完整的一条带。

如果下一步用来PCR的话，只要纯度够，完全没问题。

你的电泳液是不是很久没换了？
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2楼2011-03-03 20:13:00
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-03 20:13:00:
marker 是10kb的或者更小？

smear的有可能是提取的时候操作的问题或者样品不新鲜了，毕竟好多都是完整的一条带。

如果下一步用来PCR的话，只要纯度够，完全没问题。

你的电泳液是不是很久没换了？

电泳液是经常换的~，marker 是100bp的（即是100bp-1500bp范围共11个条带），样品是采血后8天左右的~

长成弥散这样了，还可以PCR，那么PCR结果 又该如何分析???
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3楼2011-03-03 20:51:10
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-03 20:51:10:
电泳液是经常换的~，marker 是100bp的（即是100bp-1500bp范围共11个条带），样品是采血后8天左右的~

长成弥散这样了，还可以PCR，那么PCR结果 又该如何分析???

PCR结果的分析？ 我咋知道你扩增什么东东，扩增这个东东的目的是啥啊，呵呵。
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4楼2011-03-03 21:37:31
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-03 21:37:31:
PCR结果的分析？ 我咋知道你扩增什么东东，扩增这个东东的目的是啥啊，呵呵。

额，我的意思是如果模板不好，那么PCR的结果会受影响吧，到时候分析原因就不好分析了吧~~~
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5楼2011-03-03 22:08:57
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
xwsooo(金币+1): 2011-04-25 19:51:36
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-03 22:08:57:
额，我的意思是如果模板不好，那么PCR的结果会受影响吧，到时候分析原因就不好分析了吧~~~

如果目的片段不是很大的话，相信你的DNA质量足够了。试一把再说，呵呵
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6楼2011-03-03 22:22:39
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
xwsooo(金币+1): 2011-03-04 09:29:55
配胶的和电泳缓冲液更换新的，可以试着提高电压以减小弥散
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7楼2011-03-03 22:44:28
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wqj1988926 at 2011-03-03 22:44:28:
配胶的和电泳缓冲液更换新的，可以试着提高电压以减小弥散

嗯，胶是刚制备完的，电泳缓冲液也是经常换呢的，电压到了120V了。
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8楼2011-03-04 09:31:11
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-03 22:22:39:
如果目的片段不是很大的话，相信你的DNA质量足够了。试一把再说，呵呵

我挑了相对比较好的拿去跑，结果不稳定，不同标本做的效果差别大~~~
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9楼2011-03-04 09:32:17
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liurtxm

铜虫 (小有名气)

继续努力

★ ★ ★
看天(金币+3): 鼓励分享 新人 2011-03-04 18:47:15
DNA至少也要提到这个程度吧。图片用ACDsee Pro 修修，呵呵
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10楼2011-03-04 10:23:59
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liurtxm

铜虫 (小有名气)

参考

★
xwsooo(金币+1): 灰常感谢~~~ 2011-03-04 18:05:01
看天(金币+1): 热心 2011-03-04 18:47:34
【操作步骤】（易生物 参考）

1、取新鲜抗凝血100μl置Eppendorf（Ep）管中，离心10000rpm×1min。

2、弃上清，加ddH2O200μl，摇匀20sec。

3、加6mol/LNaI200μl，缓慢倒置摇匀20sec。

4、于管内加氯仿/异戊醇（24：1）400μl，摇匀20sec，离心12000rpm×12min

5、吸取上层水相360μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl，摇匀20sec

6、室温放置15min，离心14000rpm×12min

7、小心弃去上清，再加37%异丙醇1ml（勿摇动），离心14000rpm×12min

8、小心弃去异丙醇，晾干。

9、加50μlTE缓冲液溶解DNA，以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20℃保存。

【注意事项】

1、标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管，吸嘴等器物及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。

2、混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动作剧烈。

3、弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。

4、0.54~1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA、rRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。
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11楼2011-03-04 10:31:52
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liurtxm at 2011-03-04 10:31:52:
【操作步骤】（易生物 参考）

1、取新鲜抗凝血100μl置Eppendorf（Ep）管中，离心10000rpm×1min。

2、弃上清，加ddH2O200μl，摇匀20sec。

3、加6mol/LNaI200μl，缓慢倒置摇匀20sec。

4、于管内加氯 ...

我的方法步骤和上面的略微有所不同，不知道晾干多久？
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12楼2011-03-04 18:10:05
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liurtxm

铜虫 (小有名气)
xwsooo(金币+1): 2011-04-25 19:51:54
放在超净工作台里，吹风，看见粉末状就差不多了，加无菌水。
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13楼2011-03-23 17:35:15
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liurtxm at 2011-03-23 17:35:15:
放在超净工作台里，吹风，看见粉末状就差不多了，加无菌水。

啊，我每次都没有看见粉末状啊。。。
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14楼2011-03-23 20:21:48
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liurtxm at 2011-03-04 10:23:59:
DNA至少也要提到这个程度吧。图片用ACDsee Pro 修修，呵呵

请问，marker右边的两个图，呈弥散的，是降解么，我感觉是不是量多或浓度大导致的弥散？？
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15楼2011-03-24 12:50:17
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左岸的雅各宾

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好，我现在也在做电泳，所提的DNA也总是降解，无意中看到你这个帖子。想问你最后怎么处理的呢？
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16楼2012-12-05 21:10:29
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wudi2017

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by 左岸的雅各宾 at 2012-12-05 21:10:29
你好，我现在也在做电泳，所提的DNA也总是降解，无意中看到你这个帖子。想问你最后怎么处理的呢？

我也是，提土壤中的，一直有拖带，操作已经精细到不能再精细了。。
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17楼2017-08-04 22:12:42
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