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该死的玻璃杯

新虫 (初入文坛)

[求助] 为什么DNA提取总降解

目的:从一种丝状真菌中提取DNA进行基因组测序。

问题:使用过多种方法进行提取(液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等)。提取最后样品加TE/水溶解后样品呈乳白色,看不到通常DNA的絮状沉淀。跑胶检测,RNA条带非常亮,看不到DNA条带或者带很弱。样品提取之后曾使用RNase进行处理、使用常规方法提取后过柱子回收DNA、在提取过程中在CTAB温育之前进行RNase的处理等。该DNA样品含有很多RNA,需要处理掉RNA,但是其DNA对酶极其敏感,甚至沸水处理了半小时的RNase溶液加入样品中也可以造成DNA的降解,包括过柱子的方法也造成DNA的降解。

说明:该菌含多糖较多,生长缓慢

请高人指教!
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w2boluo

金虫 (小有名气)

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★ ★ ★
西瓜(金币+3): 有经验! 2011-08-10 23:08:58
多糖含量高的组织推荐使用CTAB法。因为多糖和核酸的性质接近,容易造成核酸和多糖共沉淀而被除去。
How about the future?
8楼2011-08-10 22:56:17
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good! EDTA通过螯合金属离子,可以抑制包括DNA酶在内的很多酶的活性。 2011-08-10 23:21:48
小丹木木: 回帖置顶 2012-02-20 15:09:29
dna容易被降解多半因为有内原性的核酸酶没有去除,解决办法是楼上说的酚氯仿抽提,但真菌基因组较大,容易因该操作发生断裂,也可以在最后加一步蛋白酶K消化,体系中加入较多量的EDTA,因杂质性质的DNA酶多数需要金属离子做辅酶。
How about the future?
9楼2011-08-10 23:08:22
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rioarsenal

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good 2011-08-11 12:10:48
1、DNA的质量与材料的状态有很大关系,一般应该取柔嫩的组织。你用的丝状真菌,是否前期培养时间比较长,菌丝有老化现象,那样的话,dna肯定不好;
2、楼上的方法比较有效,可以加入蛋白酶。
10楼2011-08-11 06:47:32
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追远0102

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 该死的玻璃杯 at 2011-05-18 09:00:30:
目的:从一种丝状真菌中提取DNA进行基因组测序。

问题:使用过多种方法进行提取(液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等)。提取最后样品加TE/水溶解后样品呈乳白色,看不到通常DNA的絮状沉淀。跑胶检测,RNA条带非常亮 ...

开学再读研,顶起,我也想知道
逐步适应
2楼2011-05-18 11:18:17
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xuguanghai

木虫 (职业作家)

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★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good! 2011-05-18 11:38:19
引用回帖:
Originally posted by 该死的玻璃杯 at 2011-05-18 09:00:30:
目的:从一种丝状真菌中提取DNA进行基因组测序。

问题:使用过多种方法进行提取(液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等)。提取最后样品加TE/水溶解后样品呈乳白色,看不到通常DNA的絮状沉淀。跑胶检测,RNA条带非常亮 ...

用TE溶解,本来就看不到DNA吧,你跑胶都看不到DNA,那你会不会是本来就没有DNA呢?
液氮研磨之后,用TE溶解,然后离心沉淀,去上清,用乙醇沉淀,再把沉淀跑电泳看有没有,之后再优化
3楼2011-05-18 11:23:36
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springTT

金虫 (正式写手)

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1949stone(金币+1): 鼓励 2011-05-18 14:39:16
我们实验室用玻璃珠法提真菌DNA,效果还不错。整个过程没有用到TE溶液,在最后加入RNase 37℃消化1h。
4楼2011-05-18 11:55:07
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


1949stone(金币+1): 是有些区别的 2011-05-18 14:39:37
真菌的没有提过,这种破菌后难道不用苯酚氯仿抽提的吗?一般不都是加苯酚氯仿抽提后,再加乙醇沉淀,然后溶解去RNA?
在等待中涅槃重生
5楼2011-05-18 12:31:14
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

我遇到的情况和楼主相似,我提大肠杆菌基因组DNA也是总是降解,用试剂盒也一样降解,加Rnase除去RNA的结果DNA也没有了,真不知道是什么原因
6楼2011-07-22 22:38:47
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永不后悔2838

铁虫 (小有名气)

我也遇到这个情况了啊,一直找不到原因,不知道楼主解决了没有呢,盼望回复~
时间是贼,偷走一切……
7楼2011-08-10 21:27:17
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