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该死的玻璃杯

新虫 (初入文坛)

[求助] 为什么DNA提取总降解

目的：从一种丝状真菌中提取DNA进行基因组测序。

问题：使用过多种方法进行提取（液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等）。提取最后样品加TE/水溶解后样品呈乳白色，看不到通常DNA的絮状沉淀。跑胶检测，RNA条带非常亮，看不到DNA条带或者带很弱。样品提取之后曾使用RNase进行处理、使用常规方法提取后过柱子回收DNA、在提取过程中在CTAB温育之前进行RNase的处理等。该DNA样品含有很多RNA，需要处理掉RNA，但是其DNA对酶极其敏感，甚至沸水处理了半小时的RNase溶液加入样品中也可以造成DNA的降解，包括过柱子的方法也造成DNA的降解。

说明：该菌含多糖较多，生长缓慢

请高人指教！
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1楼 2011-05-18 09:00:30
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 有经验！ 2011-08-10 23:08:58
多糖含量高的组织推荐使用CTAB法。因为多糖和核酸的性质接近，容易造成核酸和多糖共沉淀而被除去。
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How about the future？
8楼2011-08-10 22:56:17
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good! EDTA通过螯合金属离子，可以抑制包括DNA酶在内的很多酶的活性。 2011-08-10 23:21:48
小丹木木: 回帖置顶 2012-02-20 15:09:29
dna容易被降解多半因为有内原性的核酸酶没有去除，解决办法是楼上说的酚氯仿抽提，但真菌基因组较大，容易因该操作发生断裂，也可以在最后加一步蛋白酶K消化，体系中加入较多量的EDTA，因杂质性质的DNA酶多数需要金属离子做辅酶。
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How about the future？
9楼2011-08-10 23:08:22
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rioarsenal

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good 2011-08-11 12:10:48
1、DNA的质量与材料的状态有很大关系，一般应该取柔嫩的组织。你用的丝状真菌，是否前期培养时间比较长，菌丝有老化现象，那样的话，dna肯定不好；
2、楼上的方法比较有效，可以加入蛋白酶。
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10楼2011-08-11 06:47:32
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普通回帖

追远0102

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 该死的玻璃杯 at 2011-05-18 09:00:30:
目的：从一种丝状真菌中提取DNA进行基因组测序。

问题：使用过多种方法进行提取（液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等）。提取最后样品加TE/水溶解后样品呈乳白色，看不到通常DNA的絮状沉淀。跑胶检测，RNA条带非常亮 ...

开学再读研，顶起，我也想知道
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逐步适应
2楼2011-05-18 11:18:17
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xuguanghai

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good！ 2011-05-18 11:38:19
引用回帖:
Originally posted by 该死的玻璃杯 at 2011-05-18 09:00:30:
目的：从一种丝状真菌中提取DNA进行基因组测序。

问题：使用过多种方法进行提取（液氮研磨、珠打、玻璃棒研磨等）。提取最后样品加TE/水溶解后样品呈乳白色，看不到通常DNA的絮状沉淀。跑胶检测，RNA条带非常亮 ...

用TE溶解，本来就看不到DNA吧，你跑胶都看不到DNA，那你会不会是本来就没有DNA呢？
液氮研磨之后，用TE溶解，然后离心沉淀，去上清，用乙醇沉淀，再把沉淀跑电泳看有没有，之后再优化
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3楼2011-05-18 11:23:36
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springTT

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-05-18 14:39:16
我们实验室用玻璃珠法提真菌DNA，效果还不错。整个过程没有用到TE溶液，在最后加入RNase 37℃消化1h。
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4楼2011-05-18 11:55:07
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
1949stone(金币+1): 是有些区别的 2011-05-18 14:39:37
真菌的没有提过，这种破菌后难道不用苯酚氯仿抽提的吗？一般不都是加苯酚氯仿抽提后，再加乙醇沉淀，然后溶解去RNA？
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在等待中涅槃重生
5楼2011-05-18 12:31:14
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lilirong2009

铜虫 (小有名气)
我遇到的情况和楼主相似，我提大肠杆菌基因组DNA也是总是降解，用试剂盒也一样降解，加Rnase除去RNA的结果DNA也没有了，真不知道是什么原因
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6楼2011-07-22 22:38:47
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永不后悔2838

铁虫 (小有名气)
我也遇到这个情况了啊，一直找不到原因，不知道楼主解决了没有呢，盼望回复~
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时间是贼，偷走一切……
7楼2011-08-10 21:27:17
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