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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】提取的DNA降解了？？
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】提取的DNA降解了？？

本人最近在提取人外周血DNA（手工NAI法提取）时，电泳后发现DNA条带好多呈弥散状，貌似降解了（如下图所示），一直不得改善，请各位支个招吧，真愁人呀~~~
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1楼 2011-03-03 20:04:02
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liurtxm

铜虫 (小有名气)

参考

★
xwsooo(金币+1): 灰常感谢~~~ 2011-03-04 18:05:01
看天(金币+1): 热心 2011-03-04 18:47:34
【操作步骤】（易生物 参考）

1、取新鲜抗凝血100μl置Eppendorf（Ep）管中，离心10000rpm×1min。

2、弃上清，加ddH2O200μl，摇匀20sec。

3、加6mol/LNaI200μl，缓慢倒置摇匀20sec。

4、于管内加氯仿/异戊醇（24：1）400μl，摇匀20sec，离心12000rpm×12min

5、吸取上层水相360μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl，摇匀20sec

6、室温放置15min，离心14000rpm×12min

7、小心弃去上清，再加37%异丙醇1ml（勿摇动），离心14000rpm×12min

8、小心弃去异丙醇，晾干。

9、加50μlTE缓冲液溶解DNA，以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20℃保存。

【注意事项】

1、标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管，吸嘴等器物及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。

2、混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动作剧烈。

3、弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。

4、0.54~1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA、rRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。
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11楼2011-03-04 10:31:52
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
xwsooo(金币+1): 灰常感谢 2011-03-03 20:48:19
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-03-03 20:55:25
marker 是10kb的或者更小？

smear的有可能是提取的时候操作的问题或者样品不新鲜了，毕竟好多都是完整的一条带。

如果下一步用来PCR的话，只要纯度够，完全没问题。

你的电泳液是不是很久没换了？
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2楼2011-03-03 20:13:00
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-03 20:13:00:
marker 是10kb的或者更小？

smear的有可能是提取的时候操作的问题或者样品不新鲜了，毕竟好多都是完整的一条带。

如果下一步用来PCR的话，只要纯度够，完全没问题。

你的电泳液是不是很久没换了？

电泳液是经常换的~，marker 是100bp的（即是100bp-1500bp范围共11个条带），样品是采血后8天左右的~

长成弥散这样了，还可以PCR，那么PCR结果 又该如何分析???
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3楼2011-03-03 20:51:10
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-03 20:51:10:
电泳液是经常换的~，marker 是100bp的（即是100bp-1500bp范围共11个条带），样品是采血后8天左右的~

长成弥散这样了，还可以PCR，那么PCR结果 又该如何分析???

PCR结果的分析？ 我咋知道你扩增什么东东，扩增这个东东的目的是啥啊，呵呵。
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4楼2011-03-03 21:37:31
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