应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白降解严重，求救！
51/1返回列表
查看: 1954  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】蛋白降解严重，求救！

先谢谢大家看我的贴子，也请大家耐心的看完，帮助我解决问题，非常感谢！
我现在做的是假病毒的原核表达。假病毒会把目的基因包裹在里面，形成病毒蛋白颗粒。
我的实验步骤是这样的：
1.构建好假病毒表达载体，即把目的基因与假病毒序列及pET28a连在一起，转化BL21
2.IPTG诱导表达。
3.离心收集菌体，加入超声buffer（加入溶菌酶及PMSF），37摄氏度摇1h
4.超声破碎，工作5s，间歇5s，时间为1min，做10次
5.离心30min，收集上清
6.超声上清用RNase和DNase双酶消化1h，加入0.5M的EDTA把酶灭活
这样得到的超声上清含有我所需要的病毒蛋白颗粒

问题是：
一开始的时候诱导表达的浓度都很高，要稀释几个数量级才能用。但是随着时间推移，一直做下来，诱导表达量变得很低，双酶消化后检查病毒颗粒的浓度，也越来越低，三四个月下来，起码降了三个数量级。

请问：
我的实验步骤中有没有要注意的地方，或做错的地方？
蛋白降解这么严重的原因有哪些？
我该如何防止？

谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-02-18 12:21:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wuw579 at 2011-02-18 13:25:23:
制备蛋白的时候加点蛋白酶抑制剂 如PMSF

谢谢
是制备的那一个步骤加？我在超声buffer中加了PMSF
赞一下 回复此楼
3楼2011-02-18 14:27:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
sxxuan(金币+1): 2011-02-18 14:28:04
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-19 10:45:49
制备蛋白的时候加点蛋白酶抑制剂 如PMSF
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-02-18 13:25:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qjy_134

铜虫 (小有名气)
sxxuan(金币+1): 2011-02-21 09:32:49
你最后需要把这个东西做成什么样子
赞一下 回复此楼
5楼2011-02-18 15:04:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-19 10:46:07
引用回帖:
Originally posted by qjy_134 at 2011-02-18 15:04:07:
你最后需要把这个东西做成什么样子

超声上清用RNase和DNase消化宿主基因组DNA后，就稀释到需要的浓度，提取核酸就可以了
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2011-02-18 15:23:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭