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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何高度纯化蛋白，急急急
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darwinxie

铁杆木虫 (职业作家)

自强瓜族族长-----呆瓜大叔

[交流] 【求助/交流】如何高度纯化蛋白，急急急 已有7人参与

我是用strep-tag，纯化蛋白后跑sds-page，总是有很多扎带，如何能高度纯化蛋白呢，就只得到目的条带
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一切都会好的，雨后的天空更加明朗！人生苦短，快乐至上，加油！
1楼 2010-08-11 13:39:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-12 05:59:44
我搞蛋白晶体的，我们对蛋白的要求一般来说不低于95%。或者考蓝染色咋带较少。
根据我现在的经验来说想通过亲和层析一步获得较高纯度蛋白除非挂柱后同时再使用酶切标签，其他情况下很难做到亲和一步就获得高纯的蛋白。我们更多或采取再次使用离子交换层析，这一步可以较大的提高蛋白的纯度。最后使用凝胶过滤层析看蛋白的均一性是否良好。我的经验是不要对凝胶过滤层析这种方法报很大希望，这一步对于蛋白纯度的提高贡献很小，除非是你的蛋白和杂蛋白分子量差距巨大（几十KD）！
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8楼2010-08-11 23:38:58
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普通回帖

sqhnsd

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2):这个方法不错~~ 2010-08-11 18:03:15
可以纯化完之后切胶进行电洗脱。（SDS-PAGE之后，竖着切一小块胶进行考染并脱色，放在切剩下的胶的位置将其他没有进行染色的胶带切下放入透析袋中，并加入适量SDS-PAGE用的电泳液，透析夹夹住透析袋两端，放入水平电泳槽中，加入电泳液，向跑琼脂糖胶一样进行点洗脱，电流100mA,如果大于40KD，需要6个小时的洗脱时间，回收率不低于70%）
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2楼2010-08-11 13:49:29
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henkally

禁虫 (著名写手)
★
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3楼2010-08-11 13:49:49
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★
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lstt09nk(金币+3):淀粉酶，很热心~ 2010-08-11 18:03:37
有标签，亲和层析还有很多杂带就少见了。建议考虑下换标签，例如his-tag。

不建议像2楼说的用SDS-PAGE来做蛋白质回收，用SDS FREE的，不用做复性了，复性不是每个蛋白质都容易做得出来的。如果你的蛋白质表现出来的活性易于鉴别的的，可以考虑切胶洗脱。

3楼说的分子筛，如果是预装柱，上样量一般推荐为柱床体积的1%，这样要获得足够蛋白质就必须要极浓的蛋白质。而且过柱时流速推荐不大于1毫升每分钟，加上平衡和完事后洗柱保存，时间投入极大。不如先试一下离子交换，低盐上样高盐洗脱的，盐离子不高的话，很多蛋白质都没事，而且流速可高达5毫升每分钟。如果高盐也可耐受，还可以做疏水层析。

如果不行，就换标签his吧，省事。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2010-08-11 14:38:52
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★
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看天(金币+1):鼓励 2010-08-12 18:02:32
即使换his，可能纯度还是＜90%，还需要精纯，可以将疏水，离子交换，分子筛与亲和纯化配合使用，对于一个蛋白，要得到很高纯度，的确不容易。

也不是很建议切胶回收。
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5楼2010-08-11 14:57:07
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darwinxie

铁杆木虫 (职业作家)

自强瓜族族长-----呆瓜大叔
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-08-11 15:57:07:
即使换his，可能纯度还是＜90%，还需要精纯，可以将疏水，离子交换，分子筛与亲和纯化配合使用，对于一个蛋白，要得到很高纯度，的确不容易。

也不是很建议切胶回收。

都没做过
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6楼2010-08-11 15:11:39
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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奇怪了，我们的纤维素酶怎么用his-tag就能一步到位了呢？莫非我们的运气这几年来一直很好？
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7楼2010-08-11 16:40:25
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
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看天(金币+1):鼓励 2010-08-12 18:02:45
另外给些亲和层析内稍微提高浓度的做法：在洗杂蛋白的时候使用大量的buffer，充分洗，这样做会损失目的蛋白，却能提高纯度。
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9楼2010-08-11 23:41:06
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darwinxie

铁杆木虫 (职业作家)

自强瓜族族长-----呆瓜大叔
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-08-12 00:38:58:
我搞蛋白晶体的，我们对蛋白的要求一般来说不低于95%。或者考蓝染色咋带较少。
根据我现在的经验来说想通过亲和层析一步获得较高纯度蛋白除非挂柱后同时再使用酶切标签，其他情况下很难做到亲和一步就获得高纯的 ...

什么蛋白都可以离子交换层析吗
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10楼2010-08-11 23:52:30
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