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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白纯化镍柱、分子筛
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256k

新虫 (正式写手)

[求助] 蛋白纯化镍柱、分子筛

用tris-hcl ph8的缓冲液破菌、溶解蛋白

上镍柱时用tris-hcl ph8，200mM咪唑洗脱蛋白下来

问题：上分子筛的平衡缓冲液和洗脱缓冲液用什么？加不加咪唑呢？
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1楼 2011-11-20 11:28:08
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sspxiaoji

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
256k(金币+3): 过镍柱用500mM咪唑洗脱冻于-30度，今天拿出蛋白冰上冻融后发现沉淀不少，如何避免沉淀有没有好的建议？ 2011-11-22 10:50:28
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-22 12:42:00
就单纯分子筛的话，对缓冲液要求不高，大部分缓冲液都可以。但是分子筛经常用来对样品脱盐或替换缓冲液，然后进行后续处理，如酶切，进一步纯化等。也就是说你过了镍柱后，要把样品里的咪唑或TRIS替换成其他的缓冲液，直接用你所需要的缓冲液平衡柱子，然后上样。分子筛一般没有洗脱这个概念，就用一个缓冲液走就可以了。建议可以看看分子筛的原理，很容易理解的。
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256k
5楼2011-11-21 12:01:18
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doublehelix

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-11-20 17:18:54
256k(金币+2): 谢谢 ，说的很好 2011-11-22 10:47:12
分子筛还可以用tris-hcl ph8，毕竟你在镍柱时用的是这个缓冲液！平衡缓冲液和洗脱缓冲液均用它！过分子筛当然不能用咪唑了，用 咪唑干吗！
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2楼2011-11-20 11:31:33
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月月大可

木虫 (著名写手)
先搞清出程序吧。
看看咪唑的作用是干嘛的。
分子筛也没有平衡与洗脱缓冲液的区分。
建议楼主先辨明各种概念。
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3楼2011-11-20 20:34:12
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doublehelix

木虫 (著名写手)
LZ所谓的平衡我想应该就是指洗柱吧 ，我们也叫平衡....其实分子筛中只有一有缓冲液，只是起的作用不同，呵呵
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256k
4楼2011-11-21 00:04:37
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haoziying

至尊木虫 (职业作家)
以上各位说的都挺对的。
亲和柱和分子筛的分离原理是不一样的。过分子筛可以去掉过镍柱时的咪唑，对后续试验有帮助。
过分子筛建议你用最后你想保存的缓冲液，之后再用PBS或者TRIS-Hcl把筛子筛平衡了就行了。保存时加上防腐剂，或者乙醇。
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6楼2011-11-21 22:34:58
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256k

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by doublehelix at 2011-11-20 11:31:33:
分子筛还可以用tris-hcl ph8，毕竟你在镍柱时用的是这个缓冲液！平衡缓冲液和洗脱缓冲液均用它！过分子筛当然不能用咪唑了，用 咪唑干吗！

批评的对！
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7楼2011-11-22 10:47:39
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256k

新虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by doublehelix at 2011-11-21 00:04:37:
LZ所谓的平衡我想应该就是指洗柱吧 ，我们也叫平衡....其实分子筛中只有一有缓冲液，只是起的作用不同，呵呵

谢谢指教
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8楼2011-11-22 10:51:32
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256k

新虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by sspxiaoji at 2011-11-21 12:01:18:
就单纯分子筛的话，对缓冲液要求不高，大部分缓冲液都可以。但是分子筛经常用来对样品脱盐或替换缓冲液，然后进行后续处理，如酶切，进一步纯化等。也就是说你过了镍柱后，要把样品里的咪唑或TRIS替换成其他的缓冲 ...

谢谢指教
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9楼2011-11-22 10:52:15
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sspxiaoji

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sspxiaoji at 2011-11-21 12:01:18:
就单纯分子筛的话，对缓冲液要求不高，大部分缓冲液都可以。但是分子筛经常用来对样品脱盐或替换缓冲液，然后进行后续处理，如酶切，进一步纯化等。也就是说你过了镍柱后，要把样品里的咪唑或TRIS替换成其他的缓冲 ...

这个问题比较复杂。总体来说，蛋白质在高盐条件下是不稳定的。加上冻融之后，沉淀也不奇怪。如果要真的一个个条件去排查，有很多实验可以做。如果只是贮存过夜，我更建议储存在4度就好了，如果可以稀释几倍那更加保险。如果存储时间较长，更低的温度也许有帮助，比如-70度，同样，能稀释一下更好。
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10楼2011-11-22 17:32:17
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