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wdongdong金虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】蛋白纯化 已有3人参与
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我最近在做GST-PULL DOWN ，但纯化的HIS融合蛋白量太低，用的是NOVAGEN 的柱子，杂带到是没什么了，只是纯化的量都不到1mg/ml,所以没法往下做了，请问哪位高手做过，给点建议,HIS融合蛋白的纯化步骤如下： 用的 buffer: 8 Binding Buffer （8×= 4M NaCl，160mM Tris-HCl，40mM imidazole，pH 7.9） 8×Wash Buffer （8×= 4M NaCl，480mM imidazole，160mM Tris-HCl，pH 7.9） 4×Elute Buffer （4×= 4M imidazole，2M NaCl，80mM Tris-HCl，pH 7.9） 4×Strip Buffer （4×= 2M NaCl，400mM EDTA，80mM Tris-HCl，pH 7.9） 8×Charge Buffer （8×= 400mM NiSO4） 买的是预装柱子，所以直接纯化： 1、取下预装柱盖子，尽量吸出上方所有保存缓冲液，去掉柱下 Luer 锁紧套口。 2、10ml 1×结合缓冲液平衡树脂后让所有缓冲液尽量流尽。 注意：若未能完全去掉保存液和彻底平衡树脂，树脂的结合力会降低，也可能导致目的蛋白在纯化过程中及后续 的透析步骤中析出形成沉淀。 柱层析纯化目的蛋白 1、待结合缓冲液流干，进行上样（即适量已准备好的细菌裂解物）。 2、10ml 1×结合缓冲液洗柱。 3、10ml 1×漂洗缓冲液洗柱。 4、5ml 1×洗脱缓冲液洗脱结合蛋白。另外，也可使用5ml 1×剥离缓冲液将结合蛋白和 Ni2+同时从柱上洗脱下 来。若需要可分段收集洗脱组分（如每1ml 收集一管）。 哪位高手指教一下，谢谢 |
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