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Marado金虫 (正式写手)
Dreamer
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[求助]
求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
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目前的情况是这样的： 1.构建的表达载体测序正确 2.37℃诱导有目的条带，表达量不错. 3.上清无目的蛋白，无酶活，这个与文献相符. 4.细胞破碎后，上清有目的蛋白，但是远不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感觉破碎怎么都不澄清，可能包涵体含量较高？ 5.破碎后的细胞上清测量有酶活，且酶活力还不错. 6.目前用菌液量为1L，37℃诱导6h的细胞去破碎，之后测量酶活，发现只有上次破碎250ml细胞，单位酶活的1/3，可能是没有破碎完全？后取上清进行纯化，纯化后悲剧了……发现纯化后无酶活，目前正在进行SDS-PAGE，看流川液，洗涤液，洗脱液中是否有目的蛋白，  楼主这个表达做了几个月了，好容易到了最后一步纯化了，昨晚12点测完酶活，心都是凉的……一宿没睡好.想请大家帮忙分析一下，可能哪里出问题了. |
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 【分子生物】EPI帖 |
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Marado
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Marado
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GST标签的蛋白一般挂柱效果都比较差。而且你是在37度诱导的，细菌生长最为迅速，产生蛋白也很快，所以蛋白的折叠会比较匆忙，很有可能你的蛋白没有正确折叠，把GST标签裹在里面了，所以才会不挂柱的。 所以介意你采取低温过夜诱导，尽量让蛋白正确缓慢的折叠，这样会对你的挂柱有所改善。 还有次级选择就是用尿素变性，这样GST标签就露在外面，就肯定能够挂柱了，不过变性复性的就会很麻烦，损失较大，活性也不见得会好。 |
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