24小时热门版块排行榜

返回列表

本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

tupac225

金虫 (正式写手)

MolEPI: 5
应助: 103 (高中生)
金币: 1967.9
散金: 20
红花: 4
帖子: 460
在线: 175.4小时
虫号: 1533370
注册: 2011-12-11
性别: GG
专业: 免疫生物学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Marado: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-19 10:40:28
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励应助 2012-09-19 15:05:42

首先我觉得你的表达没有大的问题。如果觉得包涵体过多，可以考虑降低温度，30°或者16°，同时降低IPTG的浓度，。在高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此,降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
再有你的蛋白的酶活性，两次的破碎后未纯化的结果不同，这一步可能是超声的原因，因为两次的量不同，不知道你是怎么处理的？有些人认为超声功率过大会导致部分肽键断裂，不过没有被证实；总之，超声的条件是很重要的。
最后纯化的话：选择低盐浓度洗脱，一般蛋白纯化后都要除盐，在这你的蛋白虽然表达出来了，但是不代表就一定正确的折叠，这样就和包涵体一样，没有活性，你就得考虑变性再复性了，但是一般的结果不会太好。
你不是有文献吗？测酶活的时候照着文献来就是了。
最后，大肠表达系统的缺点就是可能表达的外源蛋白是没有活性的，因为大肠杆菌不会对目标蛋白进行正确修饰。而芽孢杆菌表达系统就克服了这个缺点，但是芽孢杆菌不好转化。
希望对你有用。