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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhaoxiaoming at 2012-09-19 11:07:23
"3.上清无目的蛋白，无酶活，这个与文献相符.
4.细胞破碎后，上清有目的蛋白"?
这个是什么情况，怎么破碎后就有酶活了?低温，低转速诱导蛋白会正确折叠率高，上清蛋白会高些 ；破碎后无法澄清，有白色 ...

这个酶是胞内酶，在原始菌中也是胞内的，文献中也是破碎细胞后用细胞萃取物（破碎细胞后的上清液）测定酶活的.
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11楼2012-09-19 11:11:22
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
10楼: Originally posted by tupac225 at 2012-09-19 11:08:04
破碎后一直都无法澄清，还是包涵体过多的原因，白色的沉淀里会有大量的蛋白。...

即使有包涵体，那么我破碎细胞后的上清中也有部分可溶性的目的蛋白的，而且酶活测定也说明有，怎么就挂不上柱子呢？
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12楼2012-09-19 11:12:42
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tupac225

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Marado at 2012-09-19 10:39:34
谢谢你，这个有一个问题，我蛋白表达出来了，而且测了确实有酶活，这可不可以说明折叠正确有活性呢？...

我说的是纯化后，你的蛋白可能折叠的不正确，纯化前是有活性的。
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Marado
coasttocoast。
13楼2012-09-19 11:13:06
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
送鲜花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by tupac225 at 2012-09-19 11:13:06
我说的是纯化后，你的蛋白可能折叠的不正确，纯化前是有活性的。...

纯化后蛋白折叠的不正确？纯化过程会影响蛋白折叠麽？
纯化前有活性，是否说明折叠正确？
不好意思，这方面确实不太懂，望不吝赐教
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14楼2012-09-19 11:21:20
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by Marado at 2012-09-19 11:12:42
即使有包涵体，那么我破碎细胞后的上清中也有部分可溶性的目的蛋白的，而且酶活测定也说明有，怎么就挂不上柱子呢？...

不知道你过的什么柱子？
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coasttocoast。
15楼2012-09-19 11:33:59
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其他人给的建议都很好，我说一句我自己担心的，楼主用的细胞裂解液测酶活，这是个很杂的体系，不知楼主的底物是什么，怕有同工酶或底物没那么专一性的酶的影响。再没有纯化出酶之前，楼主要测活，最好做个不过量表达的普通菌做对照，这样就会知道是其他蛋白的干扰还是真正自己的酶活。GST的标签比较大，挂柱子还是很容易的。纯化时多了解酶的性质，选合适溶液。祝楼主顺利
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16楼2012-09-19 16:31:59
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timmychina

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
pGEX表达系统，我以前做过，37℃诱导是可以的但是需要蛋白复性。我们都是26℃，稍微延长诱导时间。但是即使再怎么优化条件，GST标签仍然会表达很多。
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彩云之南的愿望还能实现吗
17楼2012-09-21 07:40:52
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
17楼: Originally posted by timmychina at 2012-09-21 07:40:52
pGEX表达系统，我以前做过，37℃诱导是可以的但是需要蛋白复性。我们都是26℃，稍微延长诱导时间。但是即使再怎么优化条件，GST标签仍然会表达很多。

谢谢，我今天决定先做个28摄氏度看看！
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18楼2012-09-21 10:08:50
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
16楼: Originally posted by ynkuaile at 2012-09-19 16:31:59
其他人给的建议都很好，我说一句我自己担心的，楼主用的细胞裂解液测酶活，这是个很杂的体系，不知楼主的底物是什么，怕有同工酶或底物没那么专一性的酶的影响。再没有纯化出酶之前，楼主要测活，最好做个不过量表达 ...

底物是海藻酸钠，能够降解这个的菌很少，大肠杆菌之类的普通菌是肯定不行的……不过安全起见，我已经做了一批普通菌出来了，准备用来作对照.谢谢提醒！
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19楼2012-09-21 10:10:04
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
15楼: Originally posted by tupac225 at 2012-09-19 11:33:59
不知道你过的什么柱子？...

是康为世纪的GST琼脂糖凝胶，型号是CW0190，买了有快一年了，之前别人做过几次别的蛋白，然后我再生柱子后做的.
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20楼2012-09-21 10:12:01
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