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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

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专业: 生物化学

[求助] 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！

目前的情况是这样的：
1.构建的表达载体测序正确
2.37℃诱导有目的条带，表达量不错.
3.上清无目的蛋白，无酶活，这个与文献相符.
4.细胞破碎后，上清有目的蛋白，但是远不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感觉破碎怎么都不澄清，可能包涵体含量较高？
5.破碎后的细胞上清测量有酶活，且酶活力还不错.
6.目前用菌液量为1L，37℃诱导6h的细胞去破碎，之后测量酶活，发现只有上次破碎250ml细胞，单位酶活的1/3，可能是没有破碎完全？后取上清进行纯化，纯化后悲剧了……发现纯化后无酶活，目前正在进行SDS-PAGE，看流川液，洗涤液，洗脱液中是否有目的蛋白，

楼主这个表达做了几个月了，好容易到了最后一步纯化了，昨晚12点测完酶活，心都是凉的……一宿没睡好.
想请大家帮忙分析一下，可能哪里出问题了.

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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?

1楼 2012-09-19 09:23:36

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ynkuaile

木虫 (小有名气)

应助: 86 (初中生)
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虫号: 982579
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专业: 生物大分子结构与功能

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

其他人给的建议都很好，我说一句我自己担心的，楼主用的细胞裂解液测酶活，这是个很杂的体系，不知楼主的底物是什么，怕有同工酶或底物没那么专一性的酶的影响。再没有纯化出酶之前，楼主要测活，最好做个不过量表达的普通菌做对照，这样就会知道是其他蛋白的干扰还是真正自己的酶活。GST的标签比较大，挂柱子还是很容易的。纯化时多了解酶的性质，选合适溶液。祝楼主顺利

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16楼2012-09-19 16:31:59

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