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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

[求助] 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！

目前的情况是这样的：
1.构建的表达载体测序正确
2.37℃诱导有目的条带，表达量不错.
3.上清无目的蛋白，无酶活，这个与文献相符.
4.细胞破碎后，上清有目的蛋白，但是远不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感觉破碎怎么都不澄清，可能包涵体含量较高？
5.破碎后的细胞上清测量有酶活，且酶活力还不错.
6.目前用菌液量为1L，37℃诱导6h的细胞去破碎，之后测量酶活，发现只有上次破碎250ml细胞，单位酶活的1/3，可能是没有破碎完全？后取上清进行纯化，纯化后悲剧了……发现纯化后无酶活，目前正在进行SDS-PAGE，看流川液，洗涤液，洗脱液中是否有目的蛋白，楼主这个表达做了几个月了，好容易到了最后一步纯化了，昨晚12点测完酶活，心都是凉的……一宿没睡好.
想请大家帮忙分析一下，可能哪里出问题了.
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1楼 2012-09-19 09:23:36
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tupac225

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Marado at 2012-09-19 10:41:53
再个，超声波我两次用的机器不一样，也有可能是破碎不完全的原因，我破碎后一直都无法澄清，有白色的沉淀，这个是蛋白？包涵体过多的缘故会不会造成破碎后白色沉淀的形成？...

破碎后一直都无法澄清，还是包涵体过多的原因，白色的沉淀里会有大量的蛋白。
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coasttocoast。
10楼2012-09-19 11:08:04
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yubin0815

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-19 15:05:52
不知道你电泳的结果怎么样了
先是看有没有纯化到目的蛋白，再就是看看纯化体系是否影响酶活
大量诱导的单位表达量与预表达相比下降是正常的 可以优化条件或者扩大体积
总之 没必要太伤心 有表达有活性都是好事 说明已经成功了大半了

另外，洗脱体积大不大？纯化后是否进行了浓缩？
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Marado
2楼2012-09-19 10:06:47
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by yubin0815 at 2012-09-19 10:06:47
不知道你电泳的结果怎么样了
先是看有没有纯化到目的蛋白，再就是看看纯化体系是否影响酶活
大量诱导的单位表达量与预表达相比下降是正常的 可以优化条件或者扩大体积
总之 没必要太伤心 有表达有活性都是好事 说 ...

刚才测了一下流川液的活性，有酶活，洗涤液没有酶活，可能是没有挂上柱子.
洗脱体积，是分了3次洗脱，每次4ml，纯化后没有进行浓缩.
PAGE还在进行中，如果是没有挂上柱子，可能的原因是什么呢，没有GST标签？我目的蛋白大小为65kDa，GST26kDa，PAGE跑出来表达量最大的条带是90+，应该带上了GST的，况且酶活测量也说明表达了，测序也是正确的.
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3楼2012-09-19 10:12:47
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Marado: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-19 10:40:37
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-19 15:06:05
引用回帖:
3楼: Originally posted by Marado at 2012-09-19 10:12:47
刚才测了一下流川液的活性，有酶活，洗涤液没有酶活，可能是没有挂上柱子.
洗脱体积，是分了3次洗脱，每次4ml，纯化后没有进行浓缩.
PAGE还在进行中，如果是没有挂上柱子，可能的原因是什么呢，没有GST标签？我目 ...

GST标签的蛋白一般挂柱效果都比较差。而且你是在37度诱导的，细菌生长最为迅速，产生蛋白也很快，所以蛋白的折叠会比较匆忙，很有可能你的蛋白没有正确折叠，把GST标签裹在里面了，所以才会不挂柱的。
所以介意你采取低温过夜诱导，尽量让蛋白正确缓慢的折叠，这样会对你的挂柱有所改善。
还有次级选择就是用尿素变性，这样GST标签就露在外面，就肯定能够挂柱了，不过变性复性的就会很麻烦，损失较大，活性也不见得会好。
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Marado
4楼2012-09-19 10:24:35
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查看全部 21 个回答
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