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Marado金虫 (正式写手)
Dreamer
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[求助]
求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
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目前的情况是这样的： 1.构建的表达载体测序正确 2.37℃诱导有目的条带，表达量不错. 3.上清无目的蛋白，无酶活，这个与文献相符. 4.细胞破碎后，上清有目的蛋白，但是远不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感觉破碎怎么都不澄清，可能包涵体含量较高？ 5.破碎后的细胞上清测量有酶活，且酶活力还不错. 6.目前用菌液量为1L，37℃诱导6h的细胞去破碎，之后测量酶活，发现只有上次破碎250ml细胞，单位酶活的1/3，可能是没有破碎完全？后取上清进行纯化，纯化后悲剧了……发现纯化后无酶活，目前正在进行SDS-PAGE，看流川液，洗涤液，洗脱液中是否有目的蛋白，  楼主这个表达做了几个月了，好容易到了最后一步纯化了，昨晚12点测完酶活，心都是凉的……一宿没睡好.想请大家帮忙分析一下，可能哪里出问题了. |
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 【分子生物】EPI帖 |
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tupac225
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首先我觉得你的表达没有大的问题。如果觉得包涵体过多，可以考虑降低温度，30°或者16°，同时降低IPTG的浓度，。在高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此,降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。 再有你的蛋白的酶活性，两次的破碎后未纯化的结果不同，这一步可能是超声的原因，因为两次的量不同，不知道你是怎么处理的？有些人认为超声功率过大会导致部分肽键断裂，不过没有被证实；总之，超声的条件是很重要的。 最后纯化的话：选择低盐浓度洗脱，一般蛋白纯化后都要除盐，在这你的蛋白虽然表达出来了，但是不代表就一定正确的折叠，这样就和包涵体一样，没有活性，你就得考虑变性再复性了，但是一般的结果不会太好。 你不是有文献吗？测酶活的时候照着文献来就是了。 最后，大肠表达系统的缺点就是可能表达的外源蛋白是没有活性的，因为大肠杆菌不会对目标蛋白进行正确修饰。而芽孢杆菌表达系统就克服了这个缺点，但是芽孢杆菌不好转化。 希望对你有用。 |
5楼2012-09-19 10:25:02
yubin0815
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Marado2楼2012-09-19 10:06:47
Marado
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GST标签的蛋白一般挂柱效果都比较差。而且你是在37度诱导的，细菌生长最为迅速，产生蛋白也很快，所以蛋白的折叠会比较匆忙，很有可能你的蛋白没有正确折叠，把GST标签裹在里面了，所以才会不挂柱的。 所以介意你采取低温过夜诱导，尽量让蛋白正确缓慢的折叠，这样会对你的挂柱有所改善。 还有次级选择就是用尿素变性，这样GST标签就露在外面，就肯定能够挂柱了，不过变性复性的就会很麻烦，损失较大，活性也不见得会好。 |
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4楼2012-09-19 10:24:35
