| 查看: 3710 | 回复: 20 | |||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
Marado金虫 (正式写手)
Dreamer
|
[求助]
求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
|
||
|
目前的情况是这样的： 1.构建的表达载体测序正确 2.37℃诱导有目的条带，表达量不错. 3.上清无目的蛋白，无酶活，这个与文献相符. 4.细胞破碎后，上清有目的蛋白，但是远不如沉淀物中目的蛋白含量高，另外感觉破碎怎么都不澄清，可能包涵体含量较高？ 5.破碎后的细胞上清测量有酶活，且酶活力还不错. 6.目前用菌液量为1L，37℃诱导6h的细胞去破碎，之后测量酶活，发现只有上次破碎250ml细胞，单位酶活的1/3，可能是没有破碎完全？后取上清进行纯化，纯化后悲剧了……发现纯化后无酶活，目前正在进行SDS-PAGE，看流川液，洗涤液，洗脱液中是否有目的蛋白，  楼主这个表达做了几个月了，好容易到了最后一步纯化了，昨晚12点测完酶活，心都是凉的……一宿没睡好.想请大家帮忙分析一下，可能哪里出问题了. |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有269人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于E-tag标记蛋白的纯化问题！~求助，谢谢帮忙~！
已经有9人回复
- 带GST标签的融合蛋白的纯化问题——急急急
已经有4人回复
- GST柱纯化蛋白 是否变性
已经有6人回复
- gst标签蛋白的表达和纯化
已经有17人回复
- GST融合蛋白表达纯化
已经有5人回复
- 蛋白互作必会，GST纯化遇到的问题
已经有13人回复
- gst标签，蛋白纯化
已经有25人回复
- GST融合蛋白纯化求助 ！！！
已经有19人回复
- 【求助/交流】蛋白质纯化的疑难问题
已经有11人回复
- 【求助/交流】带GST标签的重组蛋白的纯化？
已经有14人回复
- 【求助/交流】蛋白纯化
已经有3人回复
- 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
已经有29人回复
tupac225
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 5
- 应助: 103 (高中生)
- 金币: 1967.9
- 散金: 20
- 红花: 4
- 帖子: 460
- 在线: 175.4小时
- 虫号: 1533370
- 注册: 2011-12-11
- 性别: GG
- 专业: 免疫生物学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Marado: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-19 10:40:28
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励应助 2012-09-19 15:05:42
感谢参与，应助指数 +1
Marado: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-19 10:40:28
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励应助 2012-09-19 15:05:42
|
首先我觉得你的表达没有大的问题。如果觉得包涵体过多，可以考虑降低温度，30°或者16°，同时降低IPTG的浓度，。在高水平表达时,新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此,降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。 再有你的蛋白的酶活性，两次的破碎后未纯化的结果不同，这一步可能是超声的原因，因为两次的量不同，不知道你是怎么处理的？有些人认为超声功率过大会导致部分肽键断裂，不过没有被证实；总之，超声的条件是很重要的。 最后纯化的话：选择低盐浓度洗脱，一般蛋白纯化后都要除盐，在这你的蛋白虽然表达出来了，但是不代表就一定正确的折叠，这样就和包涵体一样，没有活性，你就得考虑变性再复性了，但是一般的结果不会太好。 你不是有文献吗？测酶活的时候照着文献来就是了。 最后，大肠表达系统的缺点就是可能表达的外源蛋白是没有活性的，因为大肠杆菌不会对目标蛋白进行正确修饰。而芽孢杆菌表达系统就克服了这个缺点，但是芽孢杆菌不好转化。 希望对你有用。 |
5楼2012-09-19 10:25:02
yubin0815
木虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 1232.7
- 帖子: 128
- 在线: 258.8小时
- 虫号: 197910
- 注册: 2006-02-25
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
Marado2楼2012-09-19 10:06:47
Marado
金虫 (正式写手)
Dreamer
- MolEPI: 2
- 应助: 81 (初中生)
- 金币: 1458.8
- 散金: 100
- 红花: 1
- 帖子: 430
- 在线: 196.7小时
- 虫号: 1512351
- 注册: 2011-11-27
- 专业: 生物化学
3楼2012-09-19 10:12:47
gelois
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 59 (初中生)
- 金币: 6015.3
- 红花: 2
- 帖子: 375
- 在线: 149.6小时
- 虫号: 1655503
- 注册: 2012-03-01
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Marado: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-19 10:40:37
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-19 15:06:05
感谢参与，应助指数 +1
Marado: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-19 10:40:37
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-19 15:06:05
|
GST标签的蛋白一般挂柱效果都比较差。而且你是在37度诱导的，细菌生长最为迅速，产生蛋白也很快，所以蛋白的折叠会比较匆忙，很有可能你的蛋白没有正确折叠，把GST标签裹在里面了，所以才会不挂柱的。 所以介意你采取低温过夜诱导，尽量让蛋白正确缓慢的折叠，这样会对你的挂柱有所改善。 还有次级选择就是用尿素变性，这样GST标签就露在外面，就肯定能够挂柱了，不过变性复性的就会很麻烦，损失较大，活性也不见得会好。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
4楼2012-09-19 10:24:35
30
