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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】MBP融合蛋白活性低? 已有5人参与

我在用MBP tag表达蛋白,亲和纯化后得到的融合蛋白,测定活性。发现活性很低,用factor Xa酶切,切完之后跑电泳发现有MBP,目的蛋白却不见了,是怎么回事?小弟都要愁死啦,实验做不出来没法毕业啊!敬请各位高人指点!
大家都是怎么做的?
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一个人可以不成功,但不可以不成长!
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joyva

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 阿娇阿娇 at 2012-03-10 13:56:09
你好,看到你几个月前发的贴子,有问题想请教一下。我现在也想把纯化过的MBP融合蛋白进行Xa因子蛋白酶酶切,请问一下你是放在4度切的吗?酶切完在过柱子之前先跑个胶?切完怎么把蛋白酶给除去啊?  我最关心的是最后 ...

蛋白酶有标签吧
人生没有彩排,珍惜每一天!
9楼2014-01-26 23:30:01
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

怎么无人理睬!?
一个人可以不成功,但不可以不成长!
2楼2010-04-24 09:12:10
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子

Anson1358(金币+6): 2010-04-24 17:51
使用MBP tag有一个问题,就是MBP表达效率太高,拖着后面的蛋白快速表达,而导致你的目的蛋白没有折叠好。
用蛋白酶切完后跑电泳,染胶的时候不要去掉浓缩胶,染完后注意看一下浓缩胶和分离胶之间是不是有一条带。如果有,那证明你的蛋白没有折叠好,切除前面的tag后聚集在一起形成大的复合体,跑不进分离胶。
如果出现这种情况,那你可以尝试在亲和纯化之后先过一个分子筛,看一下融合蛋白有没有聚集,把没有聚集的部分回收再用蛋白酶切。
如果依然聚集,那没办法了,换载体吧。
生命的海洋里,我是蓝色的一滴
3楼2010-04-24 10:56:58
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

谢谢楼上的指点!要是低温诱导表达的话,会不会效果好一点?
一个人可以不成功,但不可以不成长!
4楼2010-04-25 10:27:05
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