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zplipeng

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】关于GFP融合的蛋白的一些问题

各位高人，想把GFP基因融合的已有蛋白的后面，问一下比较弱的几个问题：
1、GFP融合基因都是融合的整个基因么？还是其中的一段呢？
2、是不是不能破坏GFP基因的起始ATG啊？
3、需要注意那些方面的问题恩？
多谢多谢啦。。。。
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1楼 2010-12-20 16:20:05
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3):辛苦 2010-12-20 17:08:48
融合蛋白的意思是一起转录一起翻译，然后两个蛋白是黏在一起不是分开的
你的目的蛋白翻译出来就会在C或N端带了GFP，看你的质粒怎么设计的
一般ATG质粒上面有了（不然就自己设计）
而且多克隆位点都不会在GFP内部所以不会破坏GFP的起始密码子
就按照普通的表达蛋白的克隆做就行了
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2楼2010-12-20 16:53:13
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zplipeng

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-20 16:53:13:
融合蛋白的意思是一起转录一起翻译，然后两个蛋白是黏在一起不是分开的
你的目的蛋白翻译出来就会在C或N端带了GFP，看你的质粒怎么设计的
一般ATG质粒上面有了（不然就自己设计）
而且多克隆位点都不会在GFP内 ...

意思就是：我直接在要表达蛋白的C端按照不移码原则连接上GFP就可以了，是这样吧！！！多谢了！！
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3楼2010-12-20 19:30:16
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
zplipeng(金币+3): 2010-12-20 21:28:48
引用回帖:
Originally posted by zplipeng at 2010-12-20 19:30:16:

意思就是：我直接在要表达蛋白的C端按照不移码原则连接上GFP就可以了，是这样吧！！！多谢了！！

你的质粒不带GFP的吗？如果自己连，注意不要把poly A信号加在两个之间了，否则就杯具
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4楼2010-12-20 19:52:04
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sutao1979

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2):好久不见。 2010-12-20 20:54:12
zplipeng(金币+3): 2010-12-20 21:29:52
有现成的GFP载体，直接连到clone位点就ok了，如果重新构建，一般注意是连到基因的N terminal和C terminal会有不同的效果，所以，一定要有control作对照，还有不要破坏GFP的起始密码子
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5楼2010-12-20 20:41:44
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zplipeng

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-20 19:52:04:


你的质粒不带GFP的吗？如果自己连，注意不要把poly A信号加在两个之间了，否则就杯具

对，是自己连。。多谢多谢啦
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6楼2010-12-20 21:28:16
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zplipeng

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sutao1979 at 2010-12-20 20:41:44:
有现成的GFP载体，直接连到clone位点就ok了，如果重新构建，一般注意是连到基因的N terminal和C terminal会有不同的效果，所以，一定要有control作对照，还有不要破坏GFP的起始密码子

对照应该怎么设计呢？就是连在两端看有分别有什么影响么？
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7楼2010-12-20 21:29:43
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流！:tiger06: 2010-12-20 23:32:04
zplipeng(金币+4):好的，明白了！多谢了。。。 2010-12-21 14:26:30
引用回帖:
Originally posted by zplipeng at 2010-12-20 21:29:43:

对照应该怎么设计呢？就是连在两端看有分别有什么影响么？

有啊，有些蛋白很奇怪的，融合了东西就没功能了……有的只能融合在C有的只能在N……
所以你应该设计，空质粒、插入目的片段的质粒、融合在C、融合在N、只有GFP的组。
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8楼2010-12-20 21:33:56
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