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zxd95

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 激光共聚焦显微镜观察烟草中的GFP蛋白

上学期做了转录因子基因与EYFP的融合表达载体，现在有了转基因植物，基因组PCR也检测到了基因，再进行RT-PCR进行验证。下面就要进行YFP的荧光观察，但是我没有做过这方面的实验。请使用过激光共聚焦显微镜观察过荧光蛋白的虫友进行指导。听说直接观察烟草叶片就可以了？是这样吗？
此外，观察前要对转基因烟草叶片进行怎样的处理，取什么时期或什么部位的叶片（幼叶片还是老叶片）？怎样观察？观察一个样片的价格一般是多少？
谢谢了！
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youzhi-l

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1楼 2011-10-02 17:07:20
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w2boluo

金虫 (小有名气)
★
zxd95(金币+1):谢谢参与
zxd95(金币+1): 谢谢，看来普通荧光显微镜只能使用原生质体了；我是看定位的。 2011-10-02 23:14:45
建议先用一般的荧光显微镜对转基因株系进行筛选。荧光产率在不同line中相差较大。
转录因子融合gfp一般也就是看个核定位，普通荧光显微镜足够。
叶片直接撕去下表皮，切小块泡在液体培养基或者缓冲液中就可以镜检。如果想获得较好的图像，可以考虑将叶肉细胞原生质化。
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3楼2011-10-02 20:18:28
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vcvcvc

木虫 (著名写手)
★ ★
zxd95(金币+1):谢谢参与
zxd95(金币+1): 谢谢，是看蛋白的亚细胞定位的！ 2011-10-03 18:27:33
西瓜(金币+1): good! 2011-10-04 00:42:02
不是质体定位的话，直接敲根尖。否则要游离原生质体
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4楼2011-10-03 12:04:42
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★
zxd95(金币+1):谢谢参与
zxd95(金币+1): 我在昆明，是昆明理工大学的！ 2011-10-04 10:43:27
不知道你在哪儿，我们可以帮你看；你那个是植物细胞，很好看的！呵呵
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5楼2011-10-03 22:58:14
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15031534122

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by w2boluo at 2011-10-02 20:18:28
建议先用一般的荧光显微镜对转基因株系进行筛选。荧光产率在不同line中相差较大。
转录因子融合gfp一般也就是看个核定位，普通荧光显微镜足够。
叶片直接撕去下表皮，切小块泡在液体培养基或者缓冲液中就可以镜检 ...

取下表皮直接观察的时候叶绿体的自发荧光干扰比较大，怎么可以出去呢？
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6楼2013-07-09 18:12:48
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youzhi-l

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
还没有做过亚细胞定位的实验没法回答你的问题，但是看到你的内容想问下你关于基因组PCR的问题。我自己一直在做转基因烟草的鉴定工作，但是始终不能得到合适的结果，就是我用全世金公司的supermix酶扩增出来很多非特异条带，直到60度时才能得到单一条带，可是我设计引物的理论退火温度是50度
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7楼2014-11-05 12:58:16
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zxd95

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by youzhi-l at 2014-11-05 12:58:16
还没有做过亚细胞定位的实验没法回答你的问题，但是看到你的内容想问下你关于基因组PCR的问题。我自己一直在做转基因烟草的鉴定工作，但是始终不能得到合适的结果，就是我用全世金公司的supermix酶扩增出来很多非特 ...

PCR获得条带后，连T载体，测序看对不对。暂不必纠结退火温度。
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8楼2014-11-07 21:55:07
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nach2楼
2011-10-02 20:06   回复  
zxd95(金币+1):谢谢参与
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