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亚细胞定位研究——激光共聚焦显微镜拍照问题 已有2人参与
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目前进行亚细胞定位研究，提取拟南芥叶肉原生质体进行PEG转化。研究目标采用GFP/YFP融合蛋白，但是在LSM710观察时，叶绿体有很明显的背景，尽管有些细胞是明显看到了GFP荧光，远远强于叶绿体背景，但是拍的照片只看得出叶绿体的形状。细胞器marker选择了mCherry，是参考了文献的做法。但是红色荧光和叶绿体自发荧光重合了，共聚焦室的老师说无法区分。因为对共聚焦显微镜完全没有经验，但是期望得到文献中漂亮的图片，希望能得到高手的帮助。 在文献中以下几种类型： 第一种（1）是GFP和mCherry都没有叶绿体自发荧光，单独的叶绿体自发荧光为蓝色，可以三种颜色merge； 第二种（2）是GFP和RFP都没有叶绿体自发荧光，图片中不体现叶绿体； 第三种（3）是叶绿体自发荧光为红色，目标为GFP. 请问LSM 710 能实现以上几种效果吗。该如何实现呢？  1.jpg  2.jpg  3.jpg |
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 激光共聚焦显微镜 | 植物学 |
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starseacow
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2楼2013-06-04 16:43:15
xy656691
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楼主扫的图片不错啊 3楼2013-06-04 23:01:42
4楼2013-06-15 11:57:00
5楼2013-07-01 09:56:55
6楼2013-07-01 09:58:02
7楼2013-09-26 15:21:47
8楼2013-09-26 16:27:39
【答案】应助回帖
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在510和710上都能够区分开的，GFP、mCherry、自发荧光间都能分开，如果你想使用自发荧光做为其中的一种marker，那么它和GFP共定位时均使用488激发，选择Fast模式，然后调节你的发射光光谱，将两种荧光的发射光光谱尽量远离，你可以在protoplast的GFP通道上看到叶绿体区域是很明显的黑色，而自发荧光的通道上则可以使用magenta或red色。而mCherry和自发荧光共定位时，同理，最好选择Best模式，这样激发光可以选择两个通道。GFP和mCherry共定位也是一样的道理，选择Best模式。 如果觉得效果不好，无法区分，那就使用lamda模式进行扫描，可以将自发荧光的发射光谱扫描出来，然后抽取其中能与GFP或者mCherry完全分开的那个通道进行取图。 |
9楼2014-01-11 09:15:50
10楼2015-05-03 11:13:11
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