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lushuiw银虫 (正式写手)
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激光扫描共聚焦显微镜
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| 我想用激光扫描共聚焦显微镜观察果肉细胞中的钙离子，样品采回来，该咋处理？ |
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 实验技术、方法交流 | Biological | 激光共聚焦显微镜 |
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ll9999
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3楼2012-08-19 19:06:40
lushuiw
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lushuiw
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4楼2012-08-19 21:18:14
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三.动态测量 l Physiology:细胞内离子动态变化测量 1).游离Ca2+测量 检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右） 荧光探针 激发波长 发射波长 Kd FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM Fluo4 506nm 525nm Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM Fura red 420/480nm 637nm 140nM Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM Indo-1 356nm 405/458nm 230nM Fura-2 340/380 476nm 145nM l 相对 测量 DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG) l Ca2+浓度绝对测量 l 单波长公式法 Fluo3: 530nm Kd=450nM [Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F) Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2) Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187) • 测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40） 细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M） 细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右） • 标准曲线法 根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA- Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度 • 比例荧光的测量 .双波长(比例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440) [Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2 • 细胞器的Ca2+测量 1.线粒体内游离Ca2+测量 Fluo-3 + TMRM(线粒体荧光探针，红色） 2. 特异定位的重组水母发光蛋白 水母发光蛋白与 Ca2+结合后发蓝光 用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测 细胞内游离Ca2+测量的应用 l 钙的特性 1．细胞内外的电化学梯度103-104倍 2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致胞内钙 明显升高 3．细胞内钙为细胞激活“开关” l 细胞内钙的生理作用 1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联 2．神经递质的释放 3．学习记忆的增强 4．卵子受精 5．细胞分裂和再生 6．细胞调亡 7．细胞间通讯 8．细胞信号传导 9. DNA合成 10. 基因表达 l 细胞内钙超载与疾病 1．高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病—胞内钙浓度异常 2．糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病—胞内钙浓度增高 3．人体缺钙—骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高 4．老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高 细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M） 细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右） 五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching） 定义:经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的 激光照射后,荧光物质的光化学结构被迫坏,荧光强度 下降, 且为不可逆的过程, 但此处荧光强度会渐渐恢 复, 荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散 的速率, 或分子运动速度。 R=(I2-I1 /I0-I2)´100% R-荧光漂白恢复率：代表分子的运动速度 应用：细胞间通讯， 细胞膜流动性，蛋白分子的运动 |
5楼2012-08-19 22:19:49
lushuiw
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6楼2012-08-20 08:25:53
