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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助关于融合蛋白的linker连接问题
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wjywen

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助关于融合蛋白的linker连接问题 已有1人参与

各位虫友，大家好！我准备做融合蛋白表达，已经拟定好了linker的序列。但是不知道怎么把linker和连个目的片段连接起来。谢谢大侠指导
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1楼 2013-01-23 20:26:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一种方法，有限制酶切连接的方法，先把linker设计在A基因的引物上，然后先构建在载体上，然后再把B基因插在linker的后面
第二种方法，做Overlap PCR，先获得A+linker+B的全长序列，然后再构建到载体上
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2楼2013-01-24 10:21:54
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PrimerF primerR‘   linker（45bp）   primerF’   PrimerR
primerR‘ primerF’ 和  linker 重叠,PCR连起来就行了
合成6段引物  linker部分直接合出来（你愿意合成超过60bp的大引物直接连起来也行，主要单独合一次linker以后还可以再用）
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6楼2013-01-24 11:48:45
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普通回帖

gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果linker不是很长，在引物合成的时候直接合成进去
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3楼2013-01-24 10:34:09
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wjywen

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gastrodia at 2013-01-24 10:34:09
如果linker不是很长，在引物合成的时候直接合成进去

我准备用15个氨基酸作为linker，不知道需不需要单独合成linker。直接PCR能扩进去吗？如果直接扩，是不是linker中间加酶切位点，分别在两个预联合的片段的引物可加一部分linker序列？谢谢
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4楼2013-01-24 11:36:08
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wjywen

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-01-24 10:21:54
第一种方法，有限制酶切连接的方法，先把linker设计在A基因的引物上，然后先构建在载体上，然后再把B基因插在linker的后面
第二种方法，做Overlap PCR，先获得A+linker+B的全长序列，然后再构建到载体上

谢谢
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5楼2013-01-24 11:37:30
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sanmiao

木虫 (正式写手)
请问，你的Linker是什么啊，能否分享下啊，我也在做这个呢，发现不太好设计啊！！！
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7楼2013-02-21 11:05:29
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-01-24 10:21:54
第一种方法，有限制酶切连接的方法，先把linker设计在A基因的引物上，然后先构建在载体上，然后再把B基因插在linker的后面
第二种方法，做Overlap PCR，先获得A+linker+B的全长序列，然后再构建到载体上

非常想问一下，如果选用Fc标签构建融合蛋白，那么分泌的融合蛋白都是以二聚体形式吗？会不会影响功能？linker长度？
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
8楼2014-09-18 10:01:26
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-01-24 11:48:45
PrimerF primerR‘   linker（45bp）   primerF’   PrimerR
primerR‘ primerF’ 和  linker 重叠,PCR连起来就行了
合成6段引物  linker部分直接合出来（你愿意合成超过60bp的大引物直接连起来也行，主要单独合 ...

非常想问一下，如果选用Fc标签构建融合蛋白，那么分泌的融合蛋白都是以二聚体形式吗？会不会影响功能？linker长度？
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没有人生来洒脱，都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
9楼2014-09-18 10:02:02
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小太阳zz

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我的linker也是15个氨基酸，通过overlap将两个蛋白连接起来，但是多次overlap结果都是中间搭桥部分少4个氨基酸，我想知道少这四个氨基酸，会不会对酶有影响
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走着走着，花就开了
10楼2015-08-24 11:12:28
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