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wjywen

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助关于融合蛋白的linker连接问题 已有1人参与

各位虫友,大家好!我准备做融合蛋白表达,已经拟定好了linker的序列。但是不知道怎么把linker和连个目的片段连接起来。谢谢大侠指导
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
第一种方法,有限制酶切连接的方法,先把linker设计在A基因的引物上,然后先构建在载体上,然后再把B基因插在linker的后面
第二种方法,做Overlap PCR,先获得A+linker+B的全长序列,然后再构建到载体上
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-01-24 10:21:54
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PrimerF primerR‘   linker(45bp)   primerF’   PrimerR
primerR‘ primerF’ 和  linker 重叠,PCR连起来就行了
合成6段引物  linker部分直接合出来(你愿意合成超过60bp的大引物直接连起来也行,主要单独合一次linker以后还可以再用)
6楼2013-01-24 11:48:45
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普通回帖

gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果linker不是很长,在引物合成的时候直接合成进去
3楼2013-01-24 10:34:09
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wjywen

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by gastrodia at 2013-01-24 10:34:09
如果linker不是很长,在引物合成的时候直接合成进去

我准备用15个氨基酸作为linker,不知道需不需要单独合成linker。直接PCR能扩进去吗?如果直接扩,是不是linker中间加酶切位点,分别在两个预联合的片段的引物可加一部分linker序列?谢谢
4楼2013-01-24 11:36:08
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wjywen

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-01-24 10:21:54
第一种方法,有限制酶切连接的方法,先把linker设计在A基因的引物上,然后先构建在载体上,然后再把B基因插在linker的后面
第二种方法,做Overlap PCR,先获得A+linker+B的全长序列,然后再构建到载体上

谢谢
5楼2013-01-24 11:37:30
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sanmiao

木虫 (正式写手)

请问,你的Linker是什么啊,能否分享下啊,我也在做这个呢,发现不太好设计啊!!!
7楼2013-02-21 11:05:29
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-01-24 10:21:54
第一种方法,有限制酶切连接的方法,先把linker设计在A基因的引物上,然后先构建在载体上,然后再把B基因插在linker的后面
第二种方法,做Overlap PCR,先获得A+linker+B的全长序列,然后再构建到载体上

非常想问一下,如果选用Fc标签构建融合蛋白,那么分泌的融合蛋白都是以二聚体形式吗?会不会影响功能?linker长度?
没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
8楼2014-09-18 10:01:26
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weiyuanzheng

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-01-24 11:48:45
PrimerF primerR‘   linker(45bp)   primerF’   PrimerR
primerR‘ primerF’ 和  linker 重叠,PCR连起来就行了
合成6段引物  linker部分直接合出来(你愿意合成超过60bp的大引物直接连起来也行,主要单独合 ...

非常想问一下,如果选用Fc标签构建融合蛋白,那么分泌的融合蛋白都是以二聚体形式吗?会不会影响功能?linker长度?
没有人生来洒脱,都总是在哭过以后才会感到轻松许多。
9楼2014-09-18 10:02:02
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小太阳zz

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我的linker也是15个氨基酸,通过overlap将两个蛋白连接起来,但是多次overlap结果都是中间搭桥部分少4个氨基酸,我想知道少这四个氨基酸,会不会对酶有影响
走着走着,花就开了
10楼2015-08-24 11:12:28
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