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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】MBP融合蛋白活性低? 已有5人参与

我在用MBP tag表达蛋白,亲和纯化后得到的融合蛋白,测定活性。发现活性很低,用factor Xa酶切,切完之后跑电泳发现有MBP,目的蛋白却不见了,是怎么回事?小弟都要愁死啦,实验做不出来没法毕业啊!敬请各位高人指点!
大家都是怎么做的?
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一个人可以不成功,但不可以不成长!
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子

Anson1358(金币+6): 2010-04-24 17:51
使用MBP tag有一个问题,就是MBP表达效率太高,拖着后面的蛋白快速表达,而导致你的目的蛋白没有折叠好。
用蛋白酶切完后跑电泳,染胶的时候不要去掉浓缩胶,染完后注意看一下浓缩胶和分离胶之间是不是有一条带。如果有,那证明你的蛋白没有折叠好,切除前面的tag后聚集在一起形成大的复合体,跑不进分离胶。
如果出现这种情况,那你可以尝试在亲和纯化之后先过一个分子筛,看一下融合蛋白有没有聚集,把没有聚集的部分回收再用蛋白酶切。
如果依然聚集,那没办法了,换载体吧。
生命的海洋里,我是蓝色的一滴
3楼2010-04-24 10:56:58
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

怎么无人理睬!?
一个人可以不成功,但不可以不成长!
2楼2010-04-24 09:12:10
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

谢谢楼上的指点!要是低温诱导表达的话,会不会效果好一点?
一个人可以不成功,但不可以不成长!
4楼2010-04-25 10:27:05
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子

Anson1358(金币+4): 2010-04-27 20:46
引用回帖:
Originally posted by Anson1358 at 2010-04-25 10:27:05:
谢谢楼上的指点!要是低温诱导表达的话,会不会效果好一点?

个人认为效果不大。你可以尝试一下。降低温度,降低IPTG浓度,降低转速。再做一遍,如果不行建议尽早更换载体。
生命的海洋里,我是蓝色的一滴
5楼2010-04-27 10:41:38
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