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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】MBP融合蛋白活性低？
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】MBP融合蛋白活性低？ 已有5人参与

我在用MBP tag表达蛋白，亲和纯化后得到的融合蛋白，测定活性。发现活性很低，用factor Xa酶切，切完之后跑电泳发现有MBP，目的蛋白却不见了，是怎么回事？小弟都要愁死啦，实验做不出来没法毕业啊！敬请各位高人指点！
大家都是怎么做的？
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
1楼 2010-04-23 23:22:10
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
Anson1358(金币+4): 2010-04-27 20:46
引用回帖:
Originally posted by Anson1358 at 2010-04-25 10:27:05:
谢谢楼上的指点！要是低温诱导表达的话，会不会效果好一点?

个人认为效果不大。你可以尝试一下。降低温度，降低IPTG浓度，降低转速。再做一遍，如果不行建议尽早更换载体。
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
5楼2010-04-27 10:41:38
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
怎么无人理睬！？
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
2楼2010-04-24 09:12:10
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
Anson1358(金币+6): 2010-04-24 17:51
使用MBP tag有一个问题，就是MBP表达效率太高，拖着后面的蛋白快速表达，而导致你的目的蛋白没有折叠好。
用蛋白酶切完后跑电泳，染胶的时候不要去掉浓缩胶，染完后注意看一下浓缩胶和分离胶之间是不是有一条带。如果有，那证明你的蛋白没有折叠好，切除前面的tag后聚集在一起形成大的复合体，跑不进分离胶。
如果出现这种情况，那你可以尝试在亲和纯化之后先过一个分子筛，看一下融合蛋白有没有聚集，把没有聚集的部分回收再用蛋白酶切。
如果依然聚集，那没办法了，换载体吧。
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
3楼2010-04-24 10:56:58
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
谢谢楼上的指点！要是低温诱导表达的话，会不会效果好一点?
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
4楼2010-04-25 10:27:05
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