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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎么做融合蛋白？
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1989zb

金虫 (小有名气)

[求助] 怎么做融合蛋白？

现在准备做一个融合蛋白，有两种方法不知道该用哪种好呢？
第一种：通过去掉第一个蛋白的终止子，用linker连接第二个蛋白，不知道怎么选择linker?
第二种：通过融合PCR 扩增出两个蛋白的基因全长 ，第一个蛋白的基因序列也去掉终止子，

请问这两种方法哪种更好点呢？？？
还有就是怎么设计linker呢？
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1楼 2013-10-12 21:46:01
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xiaozhu20131

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1989zb: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-10-13 09:36:51
构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有：
1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。
2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。
3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。
4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。
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面对现实，只有努力。。。
3楼2013-10-13 07:46:23
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
不明白...楼主这里说的两个方法不是一码事吗?
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2013-10-12 23:25:36
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1989zb

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-10-12 23:25:36
不明白...楼主这里说的两个方法不是一码事吗?

不是啊 一种是不设计linker一种要设计linker来来连接两个蛋白
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4楼2013-10-13 09:36:40
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1989zb

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaozhu20131 at 2013-10-13 07:46:23
构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有：
1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序列， ...

你的意思就是不需要设计linker 来连接这两个蛋白？
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5楼2013-10-13 09:37:32
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
为了避免两个蛋白的融合影响各自的正确折叠，融合蛋白表达一般要设计linker的，linker的序列和长度不是固定的，这要根据文献报道自己摸索
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6楼2013-10-13 12:18:38
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1989zb

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by joan198108 at 2013-10-13 12:18:38
为了避免两个蛋白的融合影响各自的正确折叠，融合蛋白表达一般要设计linker的，linker的序列和长度不是固定的，这要根据文献报道自己摸索

这个linker有通用的吗？？如果要自己设计，该怎么选择呢？
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7楼2013-10-13 19:27:22
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 1989zb at 2013-10-13 19:27:22
这个linker有通用的吗？？如果要自己设计，该怎么选择呢？...

各个蛋白的结构不同、大小也不一样，折叠都是不同，因此linker长短和序列应该也不同，只能根据资料自己摸索
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8楼2013-10-14 00:38:15
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1989zb

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by joan198108 at 2013-10-14 00:38:15
各个蛋白的结构不同、大小也不一样，折叠都是不同，因此linker长短和序列应该也不同，只能根据资料自己摸索...

是不是也可以不用linker，直接通过融合入PCR，连接起来呢？
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9楼2013-10-14 08:46:34
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 1989zb at 2013-10-14 08:46:34
是不是也可以不用linker，直接通过融合入PCR，连接起来呢？...

个人觉得还是有个linker比较好，否则可能通过空间位阻等相互影响对方的折叠
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10楼2013-10-14 10:18:22
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