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1989zb金虫 (小有名气)
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[求助]
怎么做融合蛋白？
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现在准备做一个融合蛋白，有两种方法不知道该用哪种好呢？ 第一种：通过去掉第一个蛋白的终止子，用linker连接第二个蛋白，不知道怎么选择linker? 第二种：通过融合PCR 扩增出两个蛋白的基因全长 ，第一个蛋白的基因序列也去掉终止子， 请问这两种方法哪种更好点呢？？？ 还有就是怎么设计linker呢？ |
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1989zb
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5楼2013-10-13 09:37:32
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【答案】应助回帖
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1989zb: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-10-13 09:36:51
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构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。 |
3楼2013-10-13 07:46:23
1989zb
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4楼2013-10-13 09:36:40
