应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题
51/1返回列表
查看: 2969  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

tutufei

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题

我的蛋白当没有组氨酸标记时的活性很好，而加上组氨酸标记后，活性稍减弱，纯化后的条带很粗且单一，但检测不到活性，我尝试了降低诱导温度，IPTG的量，效果都不理想，能不能帮我分析分析，该怎么优化呢
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-01-13 20:54:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2011-01-13 22:08:33:
没有活性可能存在两种原因：
1 his tag影响了活性，尝试切除his tag后再次测定酶活。如果目前载体上没有酶切位点可以更换至有酶切位点的载体（例如pET28a N段his tag可以使用thrombin切除his tag）。或者重新构建 ...

粗酶的活性还是有的，就是比较弱，但纯化后检测不到活性，基因两端的酶切位点分别是XhoI，NdeI，蛋白的原始菌是原核的，同时做的有三个功能类似的基因，只有这一个有问题
赞一下 回复此楼
5楼2011-01-13 22:49:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

xulanzzz

金虫 (著名写手)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 23:42:56
tutufei(金币+1): 谢谢 2011-01-21 21:59:47
可能是包涵体。。。电泳有带但是没有酶活的话，要不是蛋白失活，要不是形成的是包涵体，包涵体是没有活性的，改变处理条件或者试着进行包涵体复性。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-01-13 21:49:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xulanzzz at 2011-01-13 21:49:09:
可能是包涵体。。。电泳有带但是没有酶活的话，要不是蛋白失活，要不是形成的是包涵体，包涵体是没有活性的，改变处理条件或者试着进行包涵体复性。

包涵体不是不可溶的吗，离心时会和沉淀在一起，我是按可溶性蛋白的纯化方法纯化的
赞一下 回复此楼
3楼2011-01-13 21:57:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
rainwander(金币+2):解释的很到位，鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 23:43:29
没有活性可能存在两种原因：
1 his tag影响了活性，尝试切除his tag后再次测定酶活。如果目前载体上没有酶切位点可以更换至有酶切位点的载体（例如pET28a N段his tag可以使用thrombin切除his tag）。或者重新构建表达载体，自己引入酶切位点。

2 如果切除了标签还是没有活性那就是蛋白本身的问题了。有些真核蛋白即使上清表达也是没有正确折叠的，或者没有进行表达后修饰，没有生物活性。这种情况就比较杯具了。

[ Last edited by 月月大可 on 2011-1-13 at 22:11 ]
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-01-13 22:08:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭