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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教组氨酸标记切除问题
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zliaoyuan

新虫 (正式写手)

[求助] 请教组氨酸标记切除问题

请教大家一个问题，我用pET28a载体做表达，获得的酶进行酶学性质分析，投稿后一个审稿人说要对表达的酶进行6His切除，因为之前做没有碰到这样的问题，pET28a表达的酶怎么切除呢？我看上面也没有特别的位点啊。请大家帮忙指点一下。
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1楼 2013-03-18 21:05:00
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wizardfan

至尊木虫 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zliaoyuan: 金币+5, ★有帮助 2013-03-24 16:04:24
不是很懂，这个6his估计是指第6个氨基酸是组氨酸，可以考虑切在第6个氨基酸以后的位置，具体看你的序列了。
不过做这步之前，最好看点文献，为什么要切。不是所有的审稿人的意见都是对的，只要你有足够的理由，可以推翻的
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2楼2013-03-19 08:26:49
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zliaoyuan

新虫 (正式写手)
他的意思就是6个组氨酸标记可能会影响酶活，我检索了文献，做类似我这个功能的酶人家发表都没有切除，我测活性也没有看到有影响，本来想重做，但没有看到pET系列His标记切除的文献，所以不知道要用什么酶切，我也想过，用文献反驳，问题是这个审稿人也只是说可能会影响，他认为切除后更能真实的反映这个酶的催化活性。所以不知道怎么反驳好。
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3楼2013-03-19 09:03:20
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tjuakasa

木虫 (著名写手)

神木王虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+5, 非常正确 2013-03-20 08:10:40
一方面引用文献反驳，还有你不是测了酶活吗？没有影响，这不就是最好的反驳意见吗？
没有影响干嘛要切除？或者留着对后续提纯，回收还有用处呢。
这个六组氨酸标签，一般用凝血酶切除，但是也还会残留一两个残基，而且凭空加了一步纯化（凝血酶要去掉）
何必呢？
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如切如磋，如琢如磨
4楼2013-03-19 17:12:10
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢分享经验 2013-03-21 08:16:08
您有没有考虑过为何要除去6HIS呢？有时候去除不去除都可以，但有时候必须除去，比如一些人体多肽，名字就是以他的氨基酸个数来命名的，多一个氨基酸都不是这个多肽，虽然有时候多一个氨基酸对功能没有影响，但是免疫不一样。不知你的是属于什么情况。测活有没有影响是要求做对照的，拿没有HIS的做对照，才知道是否有影响。切除标签的话如楼上所说，不切的话，你就和编辑好好聊聊。编辑是国内的还是国外的啊，还是他学生审的稿啊？
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5楼2013-03-20 11:25:05
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

pET-28a上有凝血酶酶切位点可以直接切除His标签（如果你的His是在N端的话），一般来说由于His是带碱性的，测酶活什么的都是要切除的。每个杂志都有自己的要求，例如AAC，人家明确指出所有蛋白不能携带任何标签（for example： His-tag）。你在设计实验之前就应该考虑好的，pET-28a上还有T7标签呢，最好也注意一下在不在
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
6楼2013-03-21 22:15:26
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kagamiya

新虫 (初入文坛)
我一直都用NdeI的酶切位点，所以从来没考虑过T7 tag的问题，请问一下T7 tag可以有什么用呢？做IP？Pull Down？还是蛋白提纯？
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7楼2013-03-22 23:19:55
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zliaoyuan

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by tjuakasa at 2013-03-19 17:12:10
一方面引用文献反驳，还有你不是测了酶活吗？没有影响，这不就是最好的反驳意见吗？
没有影响干嘛要切除？或者留着对后续提纯，回收还有用处呢。
这个六组氨酸标签，一般用凝血酶切除，但是也还会残留一两个残基， ...

Mostly the experiments were done appropriately, but one thing that certainly degrades the quality of the data is that the authors did not employ the sample throughout the study in which the His-tags were cut off.  This is also pointed out by reviewer 2.  If the authors wished to indicate the true characteristics of the enzyme, they should have used His-tag-free enzymes.  Everyone knows His-tagged samples are often used in many studies and the tag system is a useful tool. Taken this comments into consideration, the authors will revise the current manuscript following the directions by reviewers.
I finally suggest major revisions to your manuscript. Therefore, I invite you to respond to the reviewer(s)' comments and revise your manuscript.

我想审稿人的意思是认为6His会影响酶的特性，虽然我们的重组酶活性还挺高的。
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8楼2013-03-24 15:54:27
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zliaoyuan

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-03-20 11:25:05
您有没有考虑过为何要除去6HIS呢？有时候去除不去除都可以，但有时候必须除去，比如一些人体多肽，名字就是以他的氨基酸个数来命名的，多一个氨基酸都不是这个多肽，虽然有时候多一个氨基酸对功能没有影响，但是免疫 ...

我这个酶就是工业用途的酶，不是药用的。要切的话，所有实验都要重做，头大。时间也来不及了。学生要毕业了。
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9楼2013-03-24 15:56:00
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zliaoyuan

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by imyting at 2013-03-21 22:15:26
pET-28a上有凝血酶酶切位点可以直接切除His标签（如果你的His是在N端的话），一般来说由于His是带碱性的，测酶活什么的都是要切除的。每个杂志都有自己的要求，例如AAC，人家明确指出所有蛋白不能携带任何标签（for ...

恩，谢谢。因为我们是做工业用酶，以前发表的文章包括类似文献重来没有看过做切除的。这次是第一次碰到。杂志没有类似要求，之前杂志接收的文章我看也没有切除。所以在想要怎么弄，如果要切，那所有实验就相当于要重新做了。
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10楼2013-03-24 15:57:59
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