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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 为何纯化带HIS标签的蛋白
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

[求助] 为何纯化带HIS标签的蛋白已有3人参与

最近要做蛋白纯化，我把目的蛋白都带上了HIS标签，但是没有做过蛋白方面的，这方面我们实验室也没有人做过，所以不太清楚，希望做过的人能够细心指导下，比如实验试剂、仪器、过程、注意事项什么的，越详细越好，谢谢各位大神了！
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justloveinuyasha
1楼2014-05-20 16:34:29
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dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
love犬夜叉: 金币+5 2014-05-21 16:08:17
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2014-05-24 21:54:00
因为带有组氨酸标签的蛋白可以被镍柱吸附，有时候C端HIS-tag,有时候N端，可以随意调节，有时候还可以两端都有~这个随意，根据载体来的
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2楼2014-05-20 20:38:41
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
love犬夜叉: 金币+1 2014-05-21 16:08:25
非常简单，看看GE的层析手册一切搞定，
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不想说什么，，，，
3楼2014-05-21 08:57:21
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yunyi712100

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
love犬夜叉: 金币+20, ★有帮助, 挺详细的，不过还是不清楚柱子那方面具体怎么操作，新手，连柱子长什么样都不知道 2014-05-24 16:25:23
laozuzunzhe: 金币+5, 鼓励热心应助！ 2014-05-24 21:54:17
人人都爱protocol。。。。
蛋白的纯化
1.菌液离心
取出三角瓶,倒入离心管中,离心(6000rpm,10min,4℃),离心之后,倒去上清.
2.细胞重悬
加上2mL的lysis buffer 洗沉淀,重悬细胞.
lysis buffer 配方是HEPES (2M,PH 7.0)200μl, Nacl (4M) 500μl, DTT 3μl, Brij 100μl, PMSF 200μl,H2O 19ml,共20ml体系.
3.初步溶解
加入溶菌酶20μl（100mg/ml）于重悬液中 ,然后冰浴20min.再用1.5ml EP管分装.
4.冷冻
将分装后的菌体放入-80℃冰箱里冷冻约20min（或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后, 取出待其融化。
5.细胞破碎
融化之后破碎细胞,用超声波细胞粉碎机破碎,每次10s, interval 20s, 20次.若量大可用压榨机来破碎.
6.离心
  离心细胞破碎液,12500rpm,1h,4℃,然后收集上清并转另一个1.5ml管,再加100μl 1M Tris -HCl buffer(PH 8.0) 到上清中。（碱性有利于蛋白的获得）可以先放-80.
7.纯化上清
⑴ 准备Ni柱
在试管中加上空柱,缓慢滴加300μl的Ni柱于空柱中,待其完全沉淀（每300μl树脂液中有5%Ni-NTA agnose）。再用2ml的AT buffer 平衡柱子（大约1h ）。AT buffer 配方：Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl,  NaCl 4M 1000μl,  Brij 20μl,  DTT 3μl, H2O 18ml.
⑵ 上样
加2ml上清到Ni柱中,并用2ml AT buffer 冲洗.(注意缓慢滴加)
⑶ 洗脱样品
   加上1ml的salt washing buffer 冲洗,其配方是AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100μl.再加上1ml的Imidazole buffer（AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml）冲洗,洗去非特异性蛋白。
⑷ 再洗脱目的蛋白
  用300μl的Elution buffer 冲洗,获得所需的特异性蛋白. Elution buffer配方：AT buffer 7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml.
8.纯化细胞破碎液的沉淀
  用urea buffer 重悬细胞沉淀, 在常温温育1h,再离心(12500rpm 1h 4℃),收集上清,重复上清纯化步骤.urea buffer的配方是Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl,NaCl 4M 1000μl, Brij 20μl, DTT 3μl, urea 8M 18ml.其余buffer 均用urea buffer来配置.
9.SDS-PAGE的鉴定
⑴配胶(根据此蛋白的大小（55KD）,配置12%的胶)
  下层胶的配方:Acr/Bis 4.44ml,下层胶缓冲液PH8.8 3.75ml,TEMED  7μl,10%APS  75μl,ddH2O  6.8ml.
  上层胶的配方是: Acr/Bis  0.75ml,上层胶缓冲液PH6.8 1.5ml,TEMED 4μl,10%APS  37.5μl,ddH2O  3.75ml.
⑵配置样品
  每管加样品2μl,5×loading buffer 4μl,再加ddH2O补全20μl体系. 混合好loading buffer和样品后,在100℃下煮约5min,然后置室温下冷却后上样。
样品1：纯化上清；样品2：纯化沉淀；
对照1：未纯化上清；对照2：未纯化沉淀；对照3：标准甘油激酶
⑶上样
  添加样品,上样 20μl,同时加上Marker,10μl.
⑷电泳
加上足够的电泳缓冲液(1×),要加在两板内外,一定要浸没过板,形成电流通路.调好电压进行电泳,约1h后,loading buffer条带跑到底,便可停止.
⑸考马斯亮蓝染色
①        将电泳后的PAGE胶取下放入容器中,加入50ml双蒸水或去离子       水,加热至沸腾后停止,继续在脱色摇床上摇动5min,弃去水溶液.
②        加上染色液,以浸没胶面为准,加热沸腾后保持状态30-60s,停止加热后继续在脱色摇床上摇动10min,弃去染色液.
③        加入约50ml的水,再加热至沸腾后保持沸腾状态30-60s,停止加热后在摇床上要5-10min,换水可完成脱色.
④        若要得到无背景的染色胶,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜.
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4楼2014-05-21 21:49:04
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yunyi712100 at 2014-05-21 21:49:04
人人都爱protocol。。。。
蛋白的纯化
1.菌液离心
取出三角瓶,倒入离心管中,离心(6000rpm,10min,4℃),离心之后,倒去上清.
2.细胞重悬
加上2mL的lysis buffer 洗沉淀,重悬细胞.
lysis buffer 配方是HEPES (2 ...

一般都是用的什么柱子？新手是不是买预装柱好些呢？预装柱什么型号的好用？使用说明产品里会附带说明吧？主要现在是不知道买什么柱子，，不太清楚的东西太多了
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justloveinuyasha
5楼2014-05-24 16:26:43
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yunyi712100

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by love犬夜叉 at 2014-05-24 16:26:43
一般都是用的什么柱子？新手是不是买预装柱好些呢？预装柱什么型号的好用？使用说明产品里会附带说明吧？主要现在是不知道买什么柱子，，不太清楚的东西太多了...

镍柱。用不同浓度的咪唑洗脱。因为咪唑和组氨酸都带正电，可在咪唑逐渐加大浓度的条件下洗脱目的蛋白。protocol里有啊。
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6楼2014-05-24 18:57:50
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