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love犬夜叉木虫 (小有名气)
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为何纯化带HIS标签的蛋白 已有3人参与
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| 最近要做蛋白纯化，我把目的蛋白都带上了HIS标签，但是没有做过蛋白方面的，这方面我们实验室也没有人做过，所以不太清楚，希望做过的人能够细心指导下，比如实验试剂、仪器、过程、注意事项什么的，越详细越好，谢谢各位大神了！ |
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dllchina
木虫 (著名写手)
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2楼2014-05-20 20:38:41
3楼2014-05-21 08:57:21
【答案】应助回帖
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love犬夜叉: 金币+20, ★有帮助, 挺详细的，不过还是不清楚柱子那方面具体怎么操作，新手，连柱子长什么样都不知道 2014-05-24 16:25:23
laozuzunzhe: 金币+5, 鼓励热心应助！ 2014-05-24 21:54:17
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人人都爱protocol。。。。 蛋白的纯化 1.菌液离心 取出三角瓶,倒入离心管中,离心(6000rpm,10min,4℃),离心之后,倒去上清. 2.细胞重悬 加上2mL的lysis buffer 洗沉淀,重悬细胞. lysis buffer 配方是HEPES (2M,PH 7.0)200μl, Nacl (4M) 500μl, DTT 3μl, Brij 100μl, PMSF 200μl,H2O 19ml,共20ml体系. 3.初步溶解 加入溶菌酶20μl（100mg/ml）于重悬液中 ,然后冰浴20min.再用1.5ml EP管分装. 4.冷冻 将分装后的菌体放入-80℃冰箱里冷冻约20min（或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后, 取出待其融化。 5.细胞破碎 融化之后破碎细胞,用超声波细胞粉碎机破碎,每次10s, interval 20s, 20次.若量大可用压榨机来破碎. 6.离心 离心细胞破碎液,12500rpm,1h,4℃,然后收集上清并转另一个1.5ml管,再加100μl 1M Tris -HCl buffer(PH 8.0) 到上清中。（碱性有利于蛋白的获得）可以先放-80. 7.纯化上清 ⑴ 准备Ni柱 在试管中加上空柱,缓慢滴加300μl的Ni柱于空柱中,待其完全沉淀（每300μl树脂液中有5%Ni-NTA agnose）。再用2ml的AT buffer 平衡柱子（大约1h ）。AT buffer 配方：Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl, NaCl 4M 1000μl, Brij 20μl, DTT 3μl, H2O 18ml. ⑵ 上样 加2ml上清到Ni柱中,并用2ml AT buffer 冲洗.(注意缓慢滴加) ⑶ 洗脱样品 加上1ml的salt washing buffer 冲洗,其配方是AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100μl.再加上1ml的Imidazole buffer（AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml）冲洗,洗去非特异性蛋白。 ⑷ 再洗脱目的蛋白 用300μl的Elution buffer 冲洗,获得所需的特异性蛋白. Elution buffer配方：AT buffer 7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml. 8.纯化细胞破碎液的沉淀 用urea buffer 重悬细胞沉淀, 在常温温育1h,再离心(12500rpm 1h 4℃),收集上清,重复上清纯化步骤.urea buffer的配方是Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl,NaCl 4M 1000μl, Brij 20μl, DTT 3μl, urea 8M 18ml.其余buffer 均用urea buffer来配置. 9.SDS-PAGE的鉴定 ⑴配胶(根据此蛋白的大小（55KD）,配置12%的胶) 下层胶的配方:Acr/Bis 4.44ml,下层胶缓冲液PH8.8 3.75ml,TEMED 7μl,10%APS 75μl,ddH2O 6.8ml. 上层胶的配方是: Acr/Bis 0.75ml,上层胶缓冲液PH6.8 1.5ml,TEMED 4μl,10%APS 37.5μl,ddH2O 3.75ml. ⑵配置样品 每管加样品2μl,5×loading buffer 4μl,再加ddH2O补全20μl体系. 混合好loading buffer和样品后,在100℃下煮约5min,然后置室温下冷却后上样。 样品1：纯化上清；样品2：纯化沉淀； 对照1：未纯化上清；对照2：未纯化沉淀；对照3：标准甘油激酶 ⑶上样 添加样品,上样 20μl,同时加上Marker,10μl. ⑷电泳 加上足够的电泳缓冲液(1×),要加在两板内外,一定要浸没过板,形成电流通路.调好电压进行电泳,约1h后,loading buffer条带跑到底,便可停止. ⑸考马斯亮蓝染色 ① 将电泳后的PAGE胶取下放入容器中,加入50ml双蒸水或去离子 水,加热至沸腾后停止,继续在脱色摇床上摇动5min,弃去水溶液. ② 加上染色液,以浸没胶面为准,加热沸腾后保持状态30-60s,停止加热后继续在脱色摇床上摇动10min,弃去染色液. ③ 加入约50ml的水,再加热至沸腾后保持沸腾状态30-60s,停止加热后在摇床上要5-10min,换水可完成脱色. ④ 若要得到无背景的染色胶,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜. |
4楼2014-05-21 21:49:04
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