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zliaoyuan

新虫 (正式写手)

[求助] 请教组氨酸标记切除问题

请教大家一个问题,我用pET28a载体做表达,获得的酶进行酶学性质分析,投稿后一个审稿人说要对表达的酶进行6His切除,因为之前做没有碰到这样的问题,pET28a表达的酶怎么切除呢?我看上面也没有特别的位点啊。请大家帮忙指点一下。
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

pET-28a上有凝血酶酶切位点可以直接切除His标签(如果你的His是在N端的话),一般来说由于His是带碱性的,测酶活什么的都是要切除的。每个杂志都有自己的要求,例如AAC,人家明确指出所有蛋白不能携带任何标签(for example: His-tag)。你在设计实验之前就应该考虑好的,pET-28a上还有T7标签呢,最好也注意一下在不在
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
6楼2013-03-21 22:15:26
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wizardfan

至尊木虫 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zliaoyuan: 金币+5, 有帮助 2013-03-24 16:04:24
不是很懂,这个6his估计是指第6个氨基酸是组氨酸,可以考虑切在第6个氨基酸以后的位置,具体看你的序列了。
不过做这步之前,最好看点文献,为什么要切。不是所有的审稿人的意见都是对的,只要你有足够的理由,可以推翻的
2楼2013-03-19 08:26:49
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zliaoyuan

新虫 (正式写手)

他的意思就是6个组氨酸标记可能会影响酶活,我检索了文献,做类似我这个功能的酶人家发表都没有切除,我测活性也没有看到有影响,本来想重做,但没有看到pET系列His标记切除的文献,所以不知道要用什么酶切,我也想过,用文献反驳,问题是这个审稿人也只是说可能会影响,他认为切除后更能真实的反映这个酶的催化活性。所以不知道怎么反驳好。
3楼2013-03-19 09:03:20
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tjuakasa

木虫 (著名写手)

神木王虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+5, 非常正确 2013-03-20 08:10:40
一方面引用文献反驳,还有你不是测了酶活吗?没有影响,这不就是最好的反驳意见吗?
没有影响干嘛要切除?或者留着对后续提纯,回收还有用处呢。
这个六组氨酸标签,一般用凝血酶切除,但是也还会残留一两个残基,而且凭空加了一步纯化(凝血酶要去掉)
何必呢?
如切如磋,如琢如磨
4楼2013-03-19 17:12:10
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