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tutufei

铜虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题

我的蛋白当没有组氨酸标记时的活性很好,而加上组氨酸标记后,活性稍减弱,纯化后的条带很粗且单一,但检测不到活性,我尝试了降低诱导温度,IPTG的量,效果都不理想,能不能帮我分析分析,该怎么优化呢
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月月大可

木虫 (著名写手)


★ ★
rainwander(金币+2):解释的很到位,鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 23:43:29
没有活性可能存在两种原因:
1 his tag影响了活性,尝试切除his tag后再次测定酶活。如果目前载体上没有酶切位点可以更换至有酶切位点的载体(例如pET28a N段his tag可以使用thrombin切除his tag)。或者重新构建表达载体,自己引入酶切位点。

2 如果切除了标签还是没有活性那就是蛋白本身的问题了。有些真核蛋白即使上清表达也是没有正确折叠的,或者没有进行表达后修饰,没有生物活性。这种情况就比较杯具了。

[ Last edited by 月月大可 on 2011-1-13 at 22:11 ]
4楼2011-01-13 22:08:33
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xulanzzz

金虫 (著名写手)



rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 23:42:56
tutufei(金币+1): 谢谢 2011-01-21 21:59:47
可能是包涵体。。。电泳有带但是没有酶活的话,要不是蛋白失活,要不是形成的是包涵体,包涵体是没有活性的,改变处理条件或者试着进行包涵体复性。
2楼2011-01-13 21:49:09
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tutufei

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by xulanzzz at 2011-01-13 21:49:09:
可能是包涵体。。。电泳有带但是没有酶活的话,要不是蛋白失活,要不是形成的是包涵体,包涵体是没有活性的,改变处理条件或者试着进行包涵体复性。

包涵体不是不可溶的吗,离心时会和沉淀在一起,我是按可溶性蛋白的纯化方法纯化的
3楼2011-01-13 21:57:05
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tutufei

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2011-01-13 22:08:33:
没有活性可能存在两种原因:
1 his tag影响了活性,尝试切除his tag后再次测定酶活。如果目前载体上没有酶切位点可以更换至有酶切位点的载体(例如pET28a N段his tag可以使用thrombin切除his tag)。或者重新构建 ...

粗酶的活性还是有的,就是比较弱,但纯化后检测不到活性,基因两端的酶切位点分别是XhoI,NdeI,蛋白的原始菌是原核的,同时做的有三个功能类似的基因,只有这一个有问题
5楼2011-01-13 22:49:17
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