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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题
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tutufei

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题

我的蛋白当没有组氨酸标记时的活性很好，而加上组氨酸标记后，活性稍减弱，纯化后的条带很粗且单一，但检测不到活性，我尝试了降低诱导温度，IPTG的量，效果都不理想，能不能帮我分析分析，该怎么优化呢
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1楼 2011-01-13 20:54:29
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月月大可

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-01-15 18:14:49:

我用不加his tag 的做过对照，相同的条件，活性相差比较大，所以我觉得是不是his tag对酶活有一定影响，但不是完全没有活性，就一直在优化诱导条件；不加IPTG的也做过对照，没有活性；序列也测了，没有问题。

那就加入酶切位点，切除his tag吧。或者把his tag 换到C端。
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11楼2011-01-15 22:55:58
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 23:42:56
tutufei(金币+1): 谢谢 2011-01-21 21:59:47
可能是包涵体。。。电泳有带但是没有酶活的话，要不是蛋白失活，要不是形成的是包涵体，包涵体是没有活性的，改变处理条件或者试着进行包涵体复性。
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2楼2011-01-13 21:49:09
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xulanzzz at 2011-01-13 21:49:09:
可能是包涵体。。。电泳有带但是没有酶活的话，要不是蛋白失活，要不是形成的是包涵体，包涵体是没有活性的，改变处理条件或者试着进行包涵体复性。

包涵体不是不可溶的吗，离心时会和沉淀在一起，我是按可溶性蛋白的纯化方法纯化的
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3楼2011-01-13 21:57:05
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
rainwander(金币+2):解释的很到位，鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 23:43:29
没有活性可能存在两种原因：
1 his tag影响了活性，尝试切除his tag后再次测定酶活。如果目前载体上没有酶切位点可以更换至有酶切位点的载体（例如pET28a N段his tag可以使用thrombin切除his tag）。或者重新构建表达载体，自己引入酶切位点。

2 如果切除了标签还是没有活性那就是蛋白本身的问题了。有些真核蛋白即使上清表达也是没有正确折叠的，或者没有进行表达后修饰，没有生物活性。这种情况就比较杯具了。

[ Last edited by 月月大可 on 2011-1-13 at 22:11 ]
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4楼2011-01-13 22:08:33
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