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现将载体构建好了，但不知道接下来怎么做？载体是pET28a 检测都合适了，现在想跑个sds–page 但不知道怎么做？ 要把检测合适的构建好的重组DNA挑斑摇菌，然后用IPTG诱导？这个诱导剂浓度是多少？ 然后就离心取上清跑SDS–PAGE？ 还是怎么做？ 跑出的胶怎么分析？跑胶用的marker 是多少？ 最后怎么算自己的目的蛋白是多大呢？ 本人是一塌糊涂 请大家给予多多的意见和资料 谢谢 谢谢 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
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 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 |
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snoopyzxx
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载体构建好了，鉴定没问题后，就转化表达菌啊，pET系列的要转化带DE3的表达菌，比如BL21（DE3）等，DH5a不能用来表达pET28a载体。 如果已经转化了表达菌。那么可以挑克隆，进行小量诱导了。 具体方法就是： 1、挑克隆到试管中，比如20ml试管中装入5mlLB培养基，加相应的抗生素。过夜培养得到种子菌。 2、同样20ml试管中装5ml LB培养基，接入摇好的种子菌，接种量1%-5%。自己看着接就行了。 3、37℃，200-250rpm培养 4、OD600到0.6-0.8时，加入母液浓度为1M的IPTG，致终浓度0.1-1.0mM。第一次小诱可以加到终浓度1mM。 5、37度过夜诱导。16小时左右。 6、第二天取1ml菌液，离心，菌体沉淀用100ul 去离子水，或PBS或TRIS buffer重选，加loading buffer跑电泳。 7、如果确定有表达，就可以破菌鉴定可溶性了。 |
2楼2012-12-30 13:24:14
3楼2012-12-30 16:42:18
4楼2012-12-30 16:44:22
snoopyzxx
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5楼2012-12-31 03:54:38
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6楼2012-12-31 03:55:54
joan198108
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楼主首先要确定构建的载体已经转化表达菌株，比如BL21，DH5a一类属于克隆宿主，不适于表达。此外，还可以根据目的蛋白性质选择相应的宿主。 确定转入到表达宿主后，先是正常培养活化菌体，然后取活化菌体转接新的培养基，待菌体OD达到一定值时加入IPTG诱导，一般终浓度为0.1-1mM，这个要自己摸索。需要摸索的还有诱导温度，这个跨度也可能比较大，但是一般是低温诱导，防止形成包涵体。诱导时间也要自己摸索，一般十几道二十几个小时。 一般诱导后，离心获得菌体，清洗后超声或者高压破菌，离心后取上清上样。Marker大小要根据自己目的蛋白大小来定，如果不知道可以选用广范围的蛋白marker。 最后一个问题，根据目的蛋白序列可以用一些软件估计其大小，网上不少相关的软件，楼主可以自己找找。 祝好运! |
7楼2012-12-31 08:59:24
8楼2012-12-31 10:18:38
9楼2012-12-31 10:18:47
10楼2012-12-31 10:20:13