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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于原核表达问题
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 关于原核表达问题 已有4人参与

现将载体构建好了，但不知道接下来怎么做？载体是pET28a  
检测都合适了，现在想跑个sds–page   但不知道怎么做？
要把检测合适的构建好的重组DNA挑斑摇菌，然后用IPTG诱导？这个诱导剂浓度是多少？
然后就离心取上清跑SDS–PAGE？
还是怎么做？  
跑出的胶怎么分析？跑胶用的marker 是多少？
最后怎么算自己的目的蛋白是多大呢？
本人是一塌糊涂  请大家给予多多的意见和资料
谢谢  谢谢

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1楼 2012-12-30 12:35:11
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
嗯，如果确定有表达，该怎么做溶解性呢？诸如测酶，提蛋白？

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3楼2012-12-30 16:42:18
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
loading buffer 就是跑平常那种琼脂糖胶用的那种？   那marker用什么的  多大的啊

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4楼2012-12-30 16:44:22
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-12-31 03:54:38
菌液离心后，用相应的各种buffer重选后，要么溶菌酶破菌，要么超声破菌，然后高速离心，把上清和沉淀分别电泳检测，就知道你表达的蛋白是可溶性表达，还是包涵体表达了。...

哦  明白了  谢谢
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8楼2012-12-31 10:18:38
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-12-31 03:55:54
你的这些问题分子克隆上面都有啊。...

恩  我查查
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9楼2012-12-31 10:18:47
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by joan198108 at 2012-12-31 08:59:24
楼主首先要确定构建的载体已经转化表达菌株，比如BL21，DH5a一类属于克隆宿主，不适于表达。此外，还可以根据目的蛋白性质选择相应的宿主。
确定转入到表达宿主后，先是正常培养活化菌体，然后取活化菌体转接新的培 ...

构建的载体已经转化到表达菌株了，转的是BL21（DE3）
我看其他文献上都是这么转的然后进行后续的诱导的
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10楼2012-12-31 10:20:13
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