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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于原核表达问题
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-12-30 18:55:57
载体构建好了，鉴定没问题后，就转化表达菌啊，pET系列的要转化带DE3的表达菌，比如BL21（DE3）等，DH5a不能用来表达pET28a载体。
如果已经转化了表达菌。那么可以挑克隆，进行小量诱导了。
具体方法就是：
1、挑克隆到试管中，比如20ml试管中装入5mlLB培养基，加相应的抗生素。过夜培养得到种子菌。
2、同样20ml试管中装5ml LB培养基，接入摇好的种子菌，接种量1%-5%。自己看着接就行了。
3、37℃，200-250rpm培养
4、OD600到0.6-0.8时，加入母液浓度为1M的IPTG，致终浓度0.1-1.0mM。第一次小诱可以加到终浓度1mM。
5、37度过夜诱导。16小时左右。
6、第二天取1ml菌液，离心，菌体沉淀用100ul 去离子水，或PBS或TRIS buffer重选，加loading buffer跑电泳。
7、如果确定有表达，就可以破菌鉴定可溶性了。
赞一下(2人) 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2012-12-30 13:24:14
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