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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于原核表达问题
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 关于原核表达问题 已有4人参与

现将载体构建好了，但不知道接下来怎么做？载体是pET28a  
检测都合适了，现在想跑个sds–page   但不知道怎么做？
要把检测合适的构建好的重组DNA挑斑摇菌，然后用IPTG诱导？这个诱导剂浓度是多少？
然后就离心取上清跑SDS–PAGE？
还是怎么做？  
跑出的胶怎么分析？跑胶用的marker 是多少？
最后怎么算自己的目的蛋白是多大呢？
本人是一塌糊涂  请大家给予多多的意见和资料
谢谢  谢谢

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1楼 2012-12-30 12:35:11
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
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amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-12-30 18:55:57
载体构建好了，鉴定没问题后，就转化表达菌啊，pET系列的要转化带DE3的表达菌，比如BL21（DE3）等，DH5a不能用来表达pET28a载体。
如果已经转化了表达菌。那么可以挑克隆，进行小量诱导了。
具体方法就是：
1、挑克隆到试管中，比如20ml试管中装入5mlLB培养基，加相应的抗生素。过夜培养得到种子菌。
2、同样20ml试管中装5ml LB培养基，接入摇好的种子菌，接种量1%-5%。自己看着接就行了。
3、37℃，200-250rpm培养
4、OD600到0.6-0.8时，加入母液浓度为1M的IPTG，致终浓度0.1-1.0mM。第一次小诱可以加到终浓度1mM。
5、37度过夜诱导。16小时左右。
6、第二天取1ml菌液，离心，菌体沉淀用100ul 去离子水，或PBS或TRIS buffer重选，加loading buffer跑电泳。
7、如果确定有表达，就可以破菌鉴定可溶性了。
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2楼2012-12-30 13:24:14
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
嗯，如果确定有表达，该怎么做溶解性呢？诸如测酶，提蛋白？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2012-12-30 16:42:18
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
loading buffer 就是跑平常那种琼脂糖胶用的那种？   那marker用什么的  多大的啊

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4楼2012-12-30 16:44:22
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
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3楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-12-30 16:42:18
嗯，如果确定有表达，该怎么做溶解性呢？诸如测酶，提蛋白？

菌液离心后，用相应的各种buffer重选后，要么溶菌酶破菌，要么超声破菌，然后高速离心，把上清和沉淀分别电泳检测，就知道你表达的蛋白是可溶性表达，还是包涵体表达了。
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5楼2012-12-31 03:54:38
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-12-30 16:44:22
loading buffer 就是跑平常那种琼脂糖胶用的那种？   那marker用什么的  多大的啊

你的这些问题分子克隆上面都有啊。
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生物资源交流QQ群：1044518333
6楼2012-12-31 03:55:54
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主首先要确定构建的载体已经转化表达菌株，比如BL21，DH5a一类属于克隆宿主，不适于表达。此外，还可以根据目的蛋白性质选择相应的宿主。
确定转入到表达宿主后，先是正常培养活化菌体，然后取活化菌体转接新的培养基，待菌体OD达到一定值时加入IPTG诱导，一般终浓度为0.1-1mM，这个要自己摸索。需要摸索的还有诱导温度，这个跨度也可能比较大，但是一般是低温诱导，防止形成包涵体。诱导时间也要自己摸索，一般十几道二十几个小时。
一般诱导后，离心获得菌体，清洗后超声或者高压破菌，离心后取上清上样。Marker大小要根据自己目的蛋白大小来定，如果不知道可以选用广范围的蛋白marker。
最后一个问题，根据目的蛋白序列可以用一些软件估计其大小，网上不少相关的软件，楼主可以自己找找。
祝好运!
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7楼2012-12-31 08:59:24
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-12-31 03:54:38
菌液离心后，用相应的各种buffer重选后，要么溶菌酶破菌，要么超声破菌，然后高速离心，把上清和沉淀分别电泳检测，就知道你表达的蛋白是可溶性表达，还是包涵体表达了。...

哦  明白了  谢谢
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8楼2012-12-31 10:18:38
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-12-31 03:55:54
你的这些问题分子克隆上面都有啊。...

恩  我查查
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9楼2012-12-31 10:18:47
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by joan198108 at 2012-12-31 08:59:24
楼主首先要确定构建的载体已经转化表达菌株，比如BL21，DH5a一类属于克隆宿主，不适于表达。此外，还可以根据目的蛋白性质选择相应的宿主。
确定转入到表达宿主后，先是正常培养活化菌体，然后取活化菌体转接新的培 ...

构建的载体已经转化到表达菌株了，转的是BL21（DE3）
我看其他文献上都是这么转的然后进行后续的诱导的
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10楼2012-12-31 10:20:13
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