应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于原核表达问题
131/2返回列表12下一页
查看: 2228  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 关于原核表达问题 已有4人参与

现将载体构建好了，但不知道接下来怎么做？载体是pET28a  
检测都合适了，现在想跑个sds–page   但不知道怎么做？
要把检测合适的构建好的重组DNA挑斑摇菌，然后用IPTG诱导？这个诱导剂浓度是多少？
然后就离心取上清跑SDS–PAGE？
还是怎么做？  
跑出的胶怎么分析？跑胶用的marker 是多少？
最后怎么算自己的目的蛋白是多大呢？
本人是一塌糊涂  请大家给予多多的意见和资料
谢谢  谢谢

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累 【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-12-30 12:35:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-12-30 18:55:57
载体构建好了，鉴定没问题后，就转化表达菌啊，pET系列的要转化带DE3的表达菌，比如BL21（DE3）等，DH5a不能用来表达pET28a载体。
如果已经转化了表达菌。那么可以挑克隆，进行小量诱导了。
具体方法就是：
1、挑克隆到试管中，比如20ml试管中装入5mlLB培养基，加相应的抗生素。过夜培养得到种子菌。
2、同样20ml试管中装5ml LB培养基，接入摇好的种子菌，接种量1%-5%。自己看着接就行了。
3、37℃，200-250rpm培养
4、OD600到0.6-0.8时，加入母液浓度为1M的IPTG，致终浓度0.1-1.0mM。第一次小诱可以加到终浓度1mM。
5、37度过夜诱导。16小时左右。
6、第二天取1ml菌液，离心，菌体沉淀用100ul 去离子水，或PBS或TRIS buffer重选，加loading buffer跑电泳。
7、如果确定有表达，就可以破菌鉴定可溶性了。
赞一下(2人) 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2012-12-30 13:24:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
嗯，如果确定有表达，该怎么做溶解性呢？诸如测酶，提蛋白？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
3楼2012-12-30 16:42:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
loading buffer 就是跑平常那种琼脂糖胶用的那种？   那marker用什么的  多大的啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
4楼2012-12-30 16:44:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-12-30 16:42:18
嗯，如果确定有表达，该怎么做溶解性呢？诸如测酶，提蛋白？

菌液离心后，用相应的各种buffer重选后，要么溶菌酶破菌，要么超声破菌，然后高速离心，把上清和沉淀分别电泳检测，就知道你表达的蛋白是可溶性表达，还是包涵体表达了。
赞一下 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
5楼2012-12-31 03:54:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-12-30 16:44:22
loading buffer 就是跑平常那种琼脂糖胶用的那种？   那marker用什么的  多大的啊

你的这些问题分子克隆上面都有啊。
赞一下 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
6楼2012-12-31 03:55:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主首先要确定构建的载体已经转化表达菌株，比如BL21，DH5a一类属于克隆宿主，不适于表达。此外，还可以根据目的蛋白性质选择相应的宿主。
确定转入到表达宿主后，先是正常培养活化菌体，然后取活化菌体转接新的培养基，待菌体OD达到一定值时加入IPTG诱导，一般终浓度为0.1-1mM，这个要自己摸索。需要摸索的还有诱导温度，这个跨度也可能比较大，但是一般是低温诱导，防止形成包涵体。诱导时间也要自己摸索，一般十几道二十几个小时。
一般诱导后，离心获得菌体，清洗后超声或者高压破菌，离心后取上清上样。Marker大小要根据自己目的蛋白大小来定，如果不知道可以选用广范围的蛋白marker。
最后一个问题，根据目的蛋白序列可以用一些软件估计其大小，网上不少相关的软件，楼主可以自己找找。
祝好运!
赞一下 回复此楼
7楼2012-12-31 08:59:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-12-31 03:54:38
菌液离心后，用相应的各种buffer重选后，要么溶菌酶破菌，要么超声破菌，然后高速离心，把上清和沉淀分别电泳检测，就知道你表达的蛋白是可溶性表达，还是包涵体表达了。...

哦  明白了  谢谢
回复此楼
8楼2012-12-31 10:18:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by snoopyzxx at 2012-12-31 03:55:54
你的这些问题分子克隆上面都有啊。...

恩  我查查
回复此楼
9楼2012-12-31 10:18:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by joan198108 at 2012-12-31 08:59:24
楼主首先要确定构建的载体已经转化表达菌株，比如BL21，DH5a一类属于克隆宿主，不适于表达。此外，还可以根据目的蛋白性质选择相应的宿主。
确定转入到表达宿主后，先是正常培养活化菌体，然后取活化菌体转接新的培 ...

构建的载体已经转化到表达菌株了，转的是BL21（DE3）
我看其他文献上都是这么转的然后进行后续的诱导的
赞一下 回复此楼
10楼2012-12-31 10:20:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 蛋白之家 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 11:41 by l0VvVHGBGRLv
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-30 11:07 by l0VvVHGBGRLv
[考博] 找导师 +4 yuanjiabao 2026-08-29 5/250 2026-08-30 09:52 by onesupeng
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 06:57 by ZPa0EcMwuECS
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 7/350 2026-08-30 06:46 by ZPa0EcMwuECS
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-30 05:48 by ZPa0EcMwuECS
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +7 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 11/550 2026-08-30 05:40 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:58 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:25 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭