应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于原核表达问题
51/1返回列表
查看: 2233  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 关于原核表达问题 已有4人参与

现将载体构建好了，但不知道接下来怎么做？载体是pET28a  
检测都合适了，现在想跑个sds–page   但不知道怎么做？
要把检测合适的构建好的重组DNA挑斑摇菌，然后用IPTG诱导？这个诱导剂浓度是多少？
然后就离心取上清跑SDS–PAGE？
还是怎么做？  
跑出的胶怎么分析？跑胶用的marker 是多少？
最后怎么算自己的目的蛋白是多大呢？
本人是一塌糊涂  请大家给予多多的意见和资料
谢谢  谢谢

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累 【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-12-30 12:35:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-12-30 16:42:18
嗯，如果确定有表达，该怎么做溶解性呢？诸如测酶，提蛋白？

菌液离心后，用相应的各种buffer重选后，要么溶菌酶破菌，要么超声破菌，然后高速离心，把上清和沉淀分别电泳检测，就知道你表达的蛋白是可溶性表达，还是包涵体表达了。
赞一下 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
5楼2012-12-31 03:54:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-12-30 18:55:57
载体构建好了，鉴定没问题后，就转化表达菌啊，pET系列的要转化带DE3的表达菌，比如BL21（DE3）等，DH5a不能用来表达pET28a载体。
如果已经转化了表达菌。那么可以挑克隆，进行小量诱导了。
具体方法就是：
1、挑克隆到试管中，比如20ml试管中装入5mlLB培养基，加相应的抗生素。过夜培养得到种子菌。
2、同样20ml试管中装5ml LB培养基，接入摇好的种子菌，接种量1%-5%。自己看着接就行了。
3、37℃，200-250rpm培养
4、OD600到0.6-0.8时，加入母液浓度为1M的IPTG，致终浓度0.1-1.0mM。第一次小诱可以加到终浓度1mM。
5、37度过夜诱导。16小时左右。
6、第二天取1ml菌液，离心，菌体沉淀用100ul 去离子水，或PBS或TRIS buffer重选，加loading buffer跑电泳。
7、如果确定有表达，就可以破菌鉴定可溶性了。
赞一下(2人) 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2012-12-30 13:24:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
嗯，如果确定有表达，该怎么做溶解性呢？诸如测酶，提蛋白？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
3楼2012-12-30 16:42:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
loading buffer 就是跑平常那种琼脂糖胶用的那种？   那marker用什么的  多大的啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
4楼2012-12-30 16:44:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 4/200 2026-08-30 14:05 by GkCVyODlx4mR
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 7/350 2026-08-30 12:13 by l0VvVHGBGRLv
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 8/400 2026-08-30 12:03 by l0VvVHGBGRLv
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 8/400 2026-08-30 12:02 by l0VvVHGBGRLv
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 11:41 by l0VvVHGBGRLv
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-30 07:05 by ZPa0EcMwuECS
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 06:57 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 01:45 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 国社科申报系统有变化 +3 kynobel 2026-08-23 3/150 2026-08-29 21:57 by 余韵清
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭