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蛋白之家

新虫 (小有名气)

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[交流] 关于原核表达问题已有4人参与

现将载体构建好了，但不知道接下来怎么做？载体是pET28a
检测都合适了，现在想跑个sds–page 但不知道怎么做？
要把检测合适的构建好的重组DNA挑斑摇菌，然后用IPTG诱导？这个诱导剂浓度是多少？
然后就离心取上清跑SDS–PAGE？
还是怎么做？
跑出的胶怎么分析？跑胶用的marker 是多少？
最后怎么算自己的目的蛋白是多大呢？
本人是一塌糊涂  请大家给予多多的意见和资料
谢谢  谢谢

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1楼 2012-12-30 12:35:11

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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

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专业: 生物技术药物

★
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楼主首先要确定构建的载体已经转化表达菌株，比如BL21，DH5a一类属于克隆宿主，不适于表达。此外，还可以根据目的蛋白性质选择相应的宿主。
确定转入到表达宿主后，先是正常培养活化菌体，然后取活化菌体转接新的培养基，待菌体OD达到一定值时加入IPTG诱导，一般终浓度为0.1-1mM，这个要自己摸索。需要摸索的还有诱导温度，这个跨度也可能比较大，但是一般是低温诱导，防止形成包涵体。诱导时间也要自己摸索，一般十几道二十几个小时。
一般诱导后，离心获得菌体，清洗后超声或者高压破菌，离心后取上清上样。Marker大小要根据自己目的蛋白大小来定，如果不知道可以选用广范围的蛋白marker。
最后一个问题，根据目的蛋白序列可以用一些软件估计其大小，网上不少相关的软件，楼主可以自己找找。
祝好运!

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