24小时热门版块排行榜    

查看: 3060  |  回复: 5
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

wxl.1989822

金虫 (小有名气)

[求助] pET28a载体蛋白表达为包涵体

RT
本人最近在做利用pET28a载体表达纯化蛋白,菌是BL21,最近连续两次跑胶都是破碎后沉淀有目的条带,上清非常淡条带。具体实验步骤也就是:诱导后菌体4度离心后破碎,不过破碎后我采用的是常温离心10分钟左右,会不会是因为这样引起的蛋白被沉淀了?注:诱导采用的是终浓度0.2 0.4 0.6 0.8 1.0的梯度。诱导温度25和37结果差不多。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

质粒构建

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wxl.1989822

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 09:42:16
可以试试IPTG浓度低一点,诱导温度16度过夜。此外,破碎后要低温离心,为什么要常温离心?常温离心也不一定会造成蛋白沉淀,但是如果蛋白不稳定的话,会有降解等风险。如果实在不可溶的话,要么尝试包涵体复性,要么 ...

请问你用过BL21 TrxB菌吗?另外我们组其他人用的pET28a和BL21(DE3)的也没有出现过包涵体,我昨天又用16过夜诱导了,还是上清没有目的蛋白,而且沉淀里的量比37度的好像还低了点。
3楼2013-03-16 11:30:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wxl.1989822: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-13 10:38:09
可以试试IPTG浓度低一点,诱导温度16度过夜。此外,破碎后要低温离心,为什么要常温离心?常温离心也不一定会造成蛋白沉淀,但是如果蛋白不稳定的话,会有降解等风险。如果实在不可溶的话,要么尝试包涵体复性,要么换载体和宿主菌。可以采用BL21 TrxB菌,同时载体可以换成带GST标签或Trx标签等有促溶作用的。
2楼2013-03-13 09:42:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

searchman

新虫 (初入文坛)

试试ArcticExpress Competent Cells,我用的载体和你一样,蛋白可溶性很好。
http://www.chem-agilent.com/pdf/strata/230191.pdf
4楼2013-03-18 01:51:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

appletree-

新虫 (小有名气)

有以下几种方法可以尝试:
1.降低温度,我用过18度,可以是有些包涵体转化为可溶性蛋白。
2.降低IPTG浓度,可降至0.01mM,设置梯度。
3.换用不同的载体
4.用分子伴侣
5楼2013-05-18 11:41:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +6 SUICHILD 2026-03-12 6/300 2026-03-17 09:24 by 雾散后相遇lc
[考研] 341求调剂 +5 捣蛋猪猪 2026-03-11 5/250 2026-03-17 06:56 by Muziwl
[考研] 0703化学336分求调剂 +3 zbzihdhd 2026-03-15 4/200 2026-03-16 23:52 by zbzihdhd
[考研] 材料专硕306英一数二 +4 z1z2z3879 2026-03-16 6/300 2026-03-16 19:38 by z1z2z3879
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +8 一鸭鸭哟 2026-03-14 9/450 2026-03-16 17:35 by 沐霖12138
[考研] 一志愿985,本科211,0817化学工程与技术319求调剂 +5 Liwangman 2026-03-15 5/250 2026-03-16 17:10 by 我的船我的海
[考研] 304求调剂 +4 ahbd 2026-03-14 4/200 2026-03-16 16:48 by 我的船我的海
[考研] 一志愿华中师范071000,325求调剂 +6 RuitingC 2026-03-12 6/300 2026-03-16 14:50 by 可淡不可忘
[考研] 326求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-15 3/150 2026-03-16 07:33 by Iveryant
[考研] 070305求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-14 4/200 2026-03-15 11:04 by peike
[考研] 材料工程专硕,一志愿中国矿业大学,总分314,求调剂 +5 无懈可击的巨人 2026-03-10 5/250 2026-03-14 00:37 by JourneyLucky
[考研] 26考研调剂 +3 ying123. 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:18 by JourneyLucky
[考研] 279求调剂 +3 抓着星星的女孩 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:47 by userper
[考研] 材料371求调剂 +9 鳄鱼? 2026-03-11 11/550 2026-03-13 22:53 by JourneyLucky
[考研] 337一志愿华南理工0805材料求调剂 +7 mysdl 2026-03-11 9/450 2026-03-13 22:43 by JourneyLucky
[考研] 0703,333分求调剂 一志愿郑州大学-物理化学 +3 李魔女斗篷 2026-03-11 3/150 2026-03-13 22:24 by JourneyLucky
[考研] 290求调剂 +9 ADT 2026-03-11 9/450 2026-03-13 21:55 by JourneyLucky
[考研] 材料工程调剂 +4 咪咪空空 2026-03-11 4/200 2026-03-13 19:57 by JourneyLucky
[考研] 一志愿211化学学硕310分求调剂 +8 努力奋斗112 2026-03-12 9/450 2026-03-13 15:41 by JourneyLucky
[考研] 420求调剂 +4 莫向外求11 2026-03-10 6/300 2026-03-12 14:41 by ruiyingmiao
信息提示
请填处理意见