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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET28a载体蛋白表达为包涵体
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)

[求助] pET28a载体蛋白表达为包涵体

RT
本人最近在做利用pET28a载体表达纯化蛋白，菌是BL21，最近连续两次跑胶都是破碎后沉淀有目的条带，上清非常淡条带。具体实验步骤也就是：诱导后菌体4度离心后破碎，不过破碎后我采用的是常温离心10分钟左右，会不会是因为这样引起的蛋白被沉淀了？注：诱导采用的是终浓度0.2 0.4 0.6 0.8 1.0的梯度。诱导温度25和37结果差不多。
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1楼 2013-03-13 08:52:20
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wxl.1989822: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-13 10:38:09
可以试试IPTG浓度低一点，诱导温度16度过夜。此外，破碎后要低温离心，为什么要常温离心？常温离心也不一定会造成蛋白沉淀，但是如果蛋白不稳定的话，会有降解等风险。如果实在不可溶的话，要么尝试包涵体复性，要么换载体和宿主菌。可以采用BL21 TrxB菌，同时载体可以换成带GST标签或Trx标签等有促溶作用的。
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2楼2013-03-13 09:42:16
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