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wxl.1989822

金虫 (小有名气)

[求助] pET28a载体蛋白表达为包涵体

RT
本人最近在做利用pET28a载体表达纯化蛋白，菌是BL21，最近连续两次跑胶都是破碎后沉淀有目的条带，上清非常淡条带。具体实验步骤也就是：诱导后菌体4度离心后破碎，不过破碎后我采用的是常温离心10分钟左右，会不会是因为这样引起的蛋白被沉淀了？注：诱导采用的是终浓度0.2 0.4 0.6 0.8 1.0的梯度。诱导温度25和37结果差不多。
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1楼 2013-03-13 08:52:20
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wxl.1989822: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-13 10:38:09
可以试试IPTG浓度低一点，诱导温度16度过夜。此外，破碎后要低温离心，为什么要常温离心？常温离心也不一定会造成蛋白沉淀，但是如果蛋白不稳定的话，会有降解等风险。如果实在不可溶的话，要么尝试包涵体复性，要么换载体和宿主菌。可以采用BL21 TrxB菌，同时载体可以换成带GST标签或Trx标签等有促溶作用的。
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2楼2013-03-13 09:42:16
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-13 09:42:16
可以试试IPTG浓度低一点，诱导温度16度过夜。此外，破碎后要低温离心，为什么要常温离心？常温离心也不一定会造成蛋白沉淀，但是如果蛋白不稳定的话，会有降解等风险。如果实在不可溶的话，要么尝试包涵体复性，要么 ...

请问你用过BL21 TrxB菌吗？另外我们组其他人用的pET28a和BL21（DE3）的也没有出现过包涵体，我昨天又用16过夜诱导了，还是上清没有目的蛋白，而且沉淀里的量比37度的好像还低了点。
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3楼2013-03-16 11:30:59
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searchman

新虫 (初入文坛)
试试ArcticExpress Competent Cells，我用的载体和你一样，蛋白可溶性很好。
http://www.chem-agilent.com/pdf/strata/230191.pdf
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4楼2013-03-18 01:51:43
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appletree-

新虫 (小有名气)
有以下几种方法可以尝试：
1.降低温度，我用过18度，可以是有些包涵体转化为可溶性蛋白。
2.降低IPTG浓度，可降至0.01mM，设置梯度。
3.换用不同的载体
4.用分子伴侣
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5楼2013-05-18 11:41:12
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韩叽哩咕噜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by searchman at 2013-03-18 01:51:43
试试ArcticExpress Competent Cells，我用的载体和你一样，蛋白可溶性很好。
http://www.chem-agilent.com/pdf/strata/230191.pdf

请问  是哪家的感受态呀？
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6楼2018-10-31 16:25:58
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