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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
: Originally posted by 小小亚杰 at 2011-12-12 16:43:43:
都克隆了,就一直走下去,一般多几个氨基酸不会影响活性。
有问题再重新PCR一下,不用千元以上吧

不是多几个了,是多了好多的,况且后面还有别的操作,怕受到影响
11楼2011-12-12 17:07:10
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海豚荣

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

joan198108(金币+1): 2011-12-12 18:06:49
酶切位点要通过引物设计来改,重新设计引物来PCR
乌托邦
12楼2011-12-12 17:28:13
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你不是去合成基因吧。。。
如果是当然没必要重新合成,设计包含全长的引物从ATG开始TAA结束,TM大约55左右,然后在上游和下游引物添加酶切位点序列,这样可以把产物连接到T载体,然后切下来连接载体即可

推荐NcoI位点ccatgg,因为它包含了atg,很多载体都是用这个位点做起始密码子

如果要直接pcr酶切,在引物5端多设计3个保护碱基~~~
13楼2011-12-12 17:58:53
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

joan198108(金币+1): 2011-12-12 18:19:04
忘记说了,NcoI如果序列里面有位点,就不能用了
如果碰到不是ATG GXX的结构,例如ATG T,可以用同尾酶进行酶切
14楼2011-12-12 17:59:59
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
: Originally posted by 海豚荣 at 2011-12-12 17:28:13:
酶切位点要通过引物设计来改,重新设计引物来PCR

谢谢
15楼2011-12-12 18:06:41
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
: Originally posted by shaquila at 2011-12-12 17:59:59:
忘记说了,NcoI如果序列里面有位点,就不能用了
如果碰到不是ATG GXX的结构,例如ATG T,可以用同尾酶进行酶切

谢谢你的耐心指教。不知道能不能Nco1和EcoR1对连有目的基因的质粒进行双酶切,这样前面的三个载体起始密码子都会被切除掉,只剩目的基因的起始密码子了。现在的问题是如何保证切割完全呢,毕竟带有目的基因的质粒很大,而切割后的质粒只是少了很小的一部分,两者不好分离
16楼2011-12-12 18:18:59
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shaquila

金虫 (正式写手)

没问题,这两个酶在通用缓冲液都没有什么星活,你就按正常酶切个两三小时,基本都能切动,如果没成功考虑去磷酸化
17楼2011-12-12 18:39:29
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guojianping

木虫 (正式写手)

有时间搞这个还不如重做,欲速则不达,慢慢来,一步步稳扎稳打
18楼2011-12-12 19:35:26
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
: Originally posted by shaquila at 2011-12-12 18:39:29:
没问题,这两个酶在通用缓冲液都没有什么星活,你就按正常酶切个两三小时,基本都能切动,如果没成功考虑去磷酸化

谢谢
19楼2011-12-12 19:45:24
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
: Originally posted by guojianping at 2011-12-12 19:35:26:
有时间搞这个还不如重做,欲速则不达,慢慢来,一步步稳扎稳打

PCR换载体吧,最稳妥的了
20楼2011-12-12 19:45:57
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