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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 用过pET28a(+)表达载体的高人请指教
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月月大可

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38
我一般使用Nde I酶切位点，这是能发挥his tag 功能又尽可能减少外援氨基酸的最优做法。但蛋白亲和层析阶段我还可以使用 凝血酶 将N段的his tag 切除。这样相当于同时进行了亲和层析纯化后再使用蛋白酶进行特异选择，一步下来即可获得极高纯度的目的蛋白。

看了楼主的回复，感觉是个外行人（我说话直）。
仅仅重新设计引物，更换酶切位点即可。不知道你在下游引入终止密码子没有，如果没有引入，这样目的蛋白就会在两端都带标签。
如果你根本不想用his tag，仅仅是用载体表达，你可以把上游酶切位点用Nco I。
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21楼2011-12-12 19:56:58
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 月月大可 at 2011-12-12 19:56:58:
我一般使用Nde I酶切位点，这是能发挥his tag 功能又尽可能减少外援氨基酸的最优做法。但蛋白亲和层析阶段我还可以使用 凝血酶 将N段的his tag 切除。这样相当于同时进行了亲和层析纯化后再使用蛋白酶进行特异选择 ...

我确实外行人，第一次接触蛋白的东西。你说的很对，我正打算设计引物在上游引入Nco1酶且位点呢，下游已经有终止密码子了，所以比较好办。谢谢指教！！！
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22楼2011-12-12 21:17:23
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
西瓜(金币+1): 提醒得好 2011-12-13 19:04:21
从nco i 起始就需要凑阅读框了
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23楼2011-12-12 21:33:29
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xiaoshidemei

新虫 (正式写手)
不会影响蛋白活性，我做过，有的蛋白会稍微影响，就看你那蛋白结构复杂不，分子量大不
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24楼2011-12-13 08:56:35
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 月月大可 at 2011-12-12 21:33:29:
从nco i 起始就需要凑阅读框了

我打算PCR换酶切位点，随后换载体
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25楼2011-12-13 09:57:14
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by xiaoshidemei at 2011-12-13 08:56:35:
不会影响蛋白活性，我做过，有的蛋白会稍微影响，就看你那蛋白结构复杂不，分子量大不

因为随后还有一些操作，可能载体序列会有影响，为保险还是换载体稳妥
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26楼2011-12-13 09:58:02
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遇见8521

新虫 (初入文坛)
★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-12-13 19:03:58
一般His Tag 对蛋白活性影响不大 可考虑用NcolI和EcoRI酶切
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27楼2011-12-13 12:37:12
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sponey

银虫 (小有名气)
学习了。
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说你什么好呢。。。
28楼2011-12-13 16:10:47
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 遇见8521 at 2011-12-13 12:37:12:
一般His Tag 对蛋白活性影响不大 可考虑用NcolI和EcoRI酶切

多谢指教！！
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29楼2011-12-13 17:00:04
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金书豆豆

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-12-12 16:17:44
先做了看看活性，没有活性的话重新构建，换酶切位点NcoI（也会多两个氨基酸），或者换载体。

为什么不会选HindIII?
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30楼2012-06-19 11:50:25
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