| 查看: 5715 | 回复: 31 | ||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
joan198108铁杆木虫 (正式写手)
|
[求助]
用过pET28a(+)表达载体的高人请指教
|
|||
本人合成了一段全基因序列，连接表达载体pET28a(+)，因为第一次做，错误的选择了EcoR1和Hind3作为酶切位点（红色标记），这样表达出的目的蛋白就会带有大量的载体氨基酸（蓝色框），影响活性。不知道哪位高人能够指点一些，该怎样处理才能保证蛋白活性？谢谢！！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 生物技术 | 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有141人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 怎样将生物膜从载体上取下来？
已经有12人回复
- 分子模拟超分子聚集，求指教！
已经有4人回复
- PET-28a载体怎么解读
已经有7人回复
- pET28a载体蛋白表达为包涵体
已经有5人回复
- pET-30a(+)不表达
已经有16人回复
- pET28a载体和目的基因
已经有9人回复
- 关于稀有密码子的优化，请求大家指教
已经有16人回复
- 有用过transgen 的t1载体的吗
已经有7人回复
- 构建了个基因的表达载体，发现有一个氨基酸发生突变
已经有10人回复
- 关于WSK和PETS5的一些初级困惑
已经有7人回复
- 麻烦半导体方面的高人帮我讲讲德拜长度。
已经有3人回复
- 急求~大虾指教，MVSP 中 CCA 分析中的分析结果和分析图，是什么意思
已经有0人回复
- 南京质检局下属事业单位食品检测岗位面试，恳请大家指教
已经有8人回复
- 【求助/交流】有谁用过载体pEASY-E1Expression kit 这个载体
已经有6人回复
- 【求助/交流】关于PEt-28a质粒载体表达蛋白质的问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】pET-28a的酶切位点
已经有6人回复
- 【求助/交流】同尾酶构建载体问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
已经有23人回复
月月大可
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 3272.1
- 散金: 1393
- 红花: 17
- 帖子: 1674
- 在线: 295.7小时
- 虫号: 549127
- 注册: 2008-04-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38
|
我一般使用Nde I酶切位点，这是能发挥his tag 功能又尽可能减少外援氨基酸的最优做法。但蛋白亲和层析阶段我还可以使用 凝血酶 将N段的his tag 切除。这样相当于同时进行了亲和层析纯化后再使用蛋白酶进行特异选择，一步下来即可获得极高纯度的目的蛋白。 看了楼主的回复，感觉是个外行人（我说话直）。 仅仅重新设计引物，更换酶切位点即可。不知道你在下游引入终止密码子没有，如果没有引入，这样目的蛋白就会在两端都带标签。 如果你根本不想用his tag，仅仅是用载体表达，你可以把上游酶切位点用Nco I。 |
21楼2011-12-12 19:56:58
shaquila
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 5
- 应助: 37 (小学生)
- 金币: 1484.8
- 散金: 59
- 红花: 14
- 帖子: 553
- 在线: 182.3小时
- 虫号: 654839
- 注册: 2008-11-15
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
joan198108(金币+2): 2011-12-12 16:29:40
joan198108(金币+2): 2011-12-12 16:29:40
|
重新构建吧，要除去这个貌似要酶切啥的 另外，一般这些tag对活性不会有非常大的影响？ |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
joan1981082楼2011-12-12 16:15:36
lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
- MolEPI: 58
- 应助: 388 (硕士)
- 贵宾: 0.238
- 金币: 17138.7
- 红花: 43
- 帖子: 2251
- 在线: 712.4小时
- 虫号: 111074
- 注册: 2005-11-20
- 专业: 生物化学
3楼2011-12-12 16:17:44
海豚荣
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 8364.5
- 红花: 2
- 帖子: 2250
- 在线: 100.7小时
- 虫号: 1149241
- 注册: 2010-11-17
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2011-12-12 16:27:08
joan198108
铁杆木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 6525.2
- 散金: 12
- 红花: 3
- 帖子: 842
- 在线: 413.5小时
- 虫号: 859607
- 注册: 2009-09-29
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
5楼2011-12-12 16:29:27
joan198108
铁杆木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 6525.2
- 散金: 12
- 红花: 3
- 帖子: 842
- 在线: 413.5小时
- 虫号: 859607
- 注册: 2009-09-29
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
6楼2011-12-12 16:30:59
joan198108
铁杆木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 6525.2
- 散金: 12
- 红花: 3
- 帖子: 842
- 在线: 413.5小时
- 虫号: 859607
- 注册: 2009-09-29
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
7楼2011-12-12 16:32:59
shaquila
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 5
- 应助: 37 (小学生)
- 金币: 1484.8
- 散金: 59
- 红花: 14
- 帖子: 553
- 在线: 182.3小时
- 虫号: 654839
- 注册: 2008-11-15
- 专业: 生物大分子结构与功能
8楼2011-12-12 16:35:59
小小亚杰
木虫 (正式写手)
- 应助: 42 (小学生)
- 金币: 3175.9
- 散金: 1032
- 红花: 4
- 帖子: 542
- 在线: 57.3小时
- 虫号: 1485167
- 注册: 2011-11-10
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
9楼2011-12-12 16:43:43
joan198108
铁杆木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 6525.2
- 散金: 12
- 红花: 3
- 帖子: 842
- 在线: 413.5小时
- 虫号: 859607
- 注册: 2009-09-29
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
10楼2011-12-12 17:06:04
28