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joan198108铁杆木虫 (正式写手)
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用过pET28a(+)表达载体的高人请指教
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本人合成了一段全基因序列，连接表达载体pET28a(+)，因为第一次做，错误的选择了EcoR1和Hind3作为酶切位点（红色标记），这样表达出的目的蛋白就会带有大量的载体氨基酸（蓝色框），影响活性。不知道哪位高人能够指点一些，该怎样处理才能保证蛋白活性？谢谢！！ |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-12-13 19:03:38
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我一般使用Nde I酶切位点，这是能发挥his tag 功能又尽可能减少外援氨基酸的最优做法。但蛋白亲和层析阶段我还可以使用 凝血酶 将N段的his tag 切除。这样相当于同时进行了亲和层析纯化后再使用蛋白酶进行特异选择，一步下来即可获得极高纯度的目的蛋白。 看了楼主的回复，感觉是个外行人（我说话直）。 仅仅重新设计引物，更换酶切位点即可。不知道你在下游引入终止密码子没有，如果没有引入，这样目的蛋白就会在两端都带标签。 如果你根本不想用his tag，仅仅是用载体表达，你可以把上游酶切位点用Nco I。 |
21楼2011-12-12 19:56:58
shaquila
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【答案】应助回帖
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joan198108(金币+2): 2011-12-12 16:29:40
joan198108(金币+2): 2011-12-12 16:29:40
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重新构建吧，要除去这个貌似要酶切啥的 另外，一般这些tag对活性不会有非常大的影响？ |
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joan1981082楼2011-12-12 16:15:36
lxj341401
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3楼2011-12-12 16:17:44
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4楼2011-12-12 16:27:08