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Sac1和Xho1的双酶切连接
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我在做Sac1和Xho1的双酶切连接，分别用这两个酶对表达载体和T载体进行双酶切3h（NEB的酶 ），T载体上我还加了保护碱基，然后分别切胶回收表达载体的大片段和T载体上的目的片段（两个片段都很亮，大小也合适，大片段约16k，目的片段1100bp）,大片段浓度是150纳克/微升，小片段是33纳克/微升，然后做连接（连接是用的promega的T4连接酶，16度16小时 22度3小时 4度过夜都试过），共20微升体系（2微升连接酶，2微升10×连接buffer， 共做了三个比例即大片段与目的片段两者的摩尔比是1:6 1:10 和1:15），再进行热击转化涂皿，分别做了阳性对照即空载体（长很多单菌落）和阴性对照（无单菌落）可以证明感受态及转化过程没问题，双酶切也成功。可为什么我的连接反应却一个单菌落也长不出来呢（抗性和浓度也没问题），哪位高人帮帮忙？？？最近快烦死了。。。。。 还有几个疑问： 1 难道是我的载体和片段的浓度不高还是太高，浓度是多少才合适呢？ 2 不好连接是不是因为我的载体太大的原因 3 难道要我分步酶切吗？ 4 求帮助啊啊啊。。。 |
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【答案】应助回帖
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33ggdf: 金币+2 2013-09-25 20:48:16
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:07:45
gyesang: 回帖置顶 2013-09-26 15:07:47
33ggdf: 金币+2 2013-09-25 20:48:16
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:07:45
gyesang: 回帖置顶 2013-09-26 15:07:47
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1. 分别用这两个酶做下单酶切验证，包括载体和片段，确定酶切位点没有问题。 2. 如果确定酶切没有问题，双酶切回收后的产物用1—2ul 跑下电泳看下，片段是否回收。 3. 鉴于载体片段很大，因此可以再加大小片段的量，提高比例到1:100都没问题（浓缩下片段）。另外换个酶连接，防止酶失效。 4. 在后期鉴定的时候最好在载体两端找引物进行PCR鉴定，或者找载体上的酶切位点鉴定，防止多拷贝插入。 5. 建议加一个载体片段自连的阴性对照。 |
6楼2013-09-25 19:07:43