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wwm2008505金虫 (小有名气)
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[求助]
双酶切之后，线状质粒的连接问题
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| 我想把一个34bp的DNA片段和一个经过酶切后的质粒（已经成线状了），设计的时候他们有粘性末端，然后用T4连接酶4度过夜连接，载体和插入片段mol比是1:5，再转化到感受态细胞中，涂平板。长出来的菌落很少，挑了之后摇菌，时间长才变浑浊。再做菌液PCR没有看到检测的条带。求助，是哪一步不对，或者是需要改进的 |
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sarah-miao
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【答案】应助回帖
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| LS很对哈，你才34bp那么小的片段不需要做连接加上的，直接把目的序列加在引物上，做PCR连上就好了，你这样太麻烦了呢 |
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wwm20085058楼2012-12-04 21:49:11
cicelyzh
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wwm2008505: 金币+5, ★有帮助 2012-12-09 15:06:33
才34bp ，你直接用PCR的方法，把目的片段加在引物上，PCR扩增整个质粒，成功率非常高的，我前几天还做了一次，测序正确 |
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7楼2012-12-04 17:13:48
9楼2012-12-07 12:49:12
【答案】应助回帖
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质粒是单酶切还是双酶切？ 如果是单酶切必须去磷酸化处理防止自连。 如果是双酶切，T4这一套是否有效，别人是否用过，因为buffer里含ATP，若buffer失效也会导致连接失败。 另外，也可能是PCR的问题，是否做了阳性和阴性对照。 |
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2楼2012-12-04 10:52:16
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