| 查看: 2794 | 回复: 13 | |||
wwm2008505金虫 (小有名气)
|
[求助]
双酶切之后，线状质粒的连接问题
|
||
| 我想把一个34bp的DNA片段和一个经过酶切后的质粒（已经成线状了），设计的时候他们有粘性末端，然后用T4连接酶4度过夜连接，载体和插入片段mol比是1:5，再转化到感受态细胞中，涂平板。长出来的菌落很少，挑了之后摇菌，时间长才变浑浊。再做菌液PCR没有看到检测的条带。求助，是哪一步不对，或者是需要改进的 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有96人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有8人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 环形质粒酶切电泳图分析求解
已经有25人回复
- 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
已经有24人回复
- 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？
已经有13人回复
- DNA的连接反应
已经有5人回复
- 【求助/交流】酶连转化
已经有24人回复
- 【求助/交流】质粒双酶切连接问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】DNA纯化问题
已经有23人回复
- 【求助/交流】双酶切质粒后，目的条带浅且前方有模糊亮带
已经有12人回复
sarah-miao
银虫 (正式写手)
- 应助: 40 (小学生)
- 金币: 184.6
- 散金: 116
- 红花: 2
- 帖子: 753
- 在线: 154.4小时
- 虫号: 1462411
- 注册: 2011-10-26
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
| LS很对哈，你才34bp那么小的片段不需要做连接加上的，直接把目的序列加在引物上，做PCR连上就好了，你这样太麻烦了呢 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
wwm20085058楼2012-12-04 21:49:11
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
5楼2012-12-04 15:11:07
6楼2012-12-04 16:28:02
huoyongting
金虫 (正式写手)
- 应助: 39 (小学生)
- 金币: 982.1
- 散金: 41
- 红花: 6
- 帖子: 392
- 在线: 110.2小时
- 虫号: 1351186
- 注册: 2011-07-20
- 性别: GG
- 专业: 抗体工程学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wwm2008505: 金币+5, ★有帮助 2012-12-09 15:06:33
感谢参与，应助指数 +1
wwm2008505: 金币+5, ★有帮助 2012-12-09 15:06:33
才34bp ，你直接用PCR的方法，把目的片段加在引物上，PCR扩增整个质粒，成功率非常高的，我前几天还做了一次，测序正确 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
7楼2012-12-04 17:13:48
9楼2012-12-07 12:49:12
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-07 16:31:29
wwm2008505: 金币+5, ★有帮助, 谢谢解答 2012-12-09 15:05:44
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-07 16:31:29
wwm2008505: 金币+5, ★有帮助, 谢谢解答 2012-12-09 15:05:44
|
质粒是单酶切还是双酶切？ 如果是单酶切必须去磷酸化处理防止自连。 如果是双酶切，T4这一套是否有效，别人是否用过，因为buffer里含ATP，若buffer失效也会导致连接失败。 另外，也可能是PCR的问题，是否做了阳性和阴性对照。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
2楼2012-12-04 10:52:16
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24334.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
3楼2012-12-04 11:29:36
xj0311
木虫 (小有名气)
- 应助: 42 (小学生)
- 金币: 2112.1
- 帖子: 119
- 在线: 28.5小时
- 虫号: 1790392
- 注册: 2012-05-02
- 性别: GG
- 专业: 病原微生物变异与耐药
4楼2012-12-04 13:37:40
wwm2008505
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1412.2
- 散金: 127
- 红花: 3
- 帖子: 297
- 在线: 187.7小时
- 虫号: 1386890
- 注册: 2011-09-02
- 性别: MM
- 专业: 基因组学
10楼2012-12-09 15:10:53
