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wwm2008505金虫 (小有名气)
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[求助]
双酶切之后，线状质粒的连接问题
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| 我想把一个34bp的DNA片段和一个经过酶切后的质粒（已经成线状了），设计的时候他们有粘性末端，然后用T4连接酶4度过夜连接，载体和插入片段mol比是1:5，再转化到感受态细胞中，涂平板。长出来的菌落很少，挑了之后摇菌，时间长才变浑浊。再做菌液PCR没有看到检测的条带。求助，是哪一步不对，或者是需要改进的 |
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wwm2008505
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11楼2012-12-09 15:12:16
【答案】应助回帖
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wwm2008505: 金币+5, ★有帮助, 谢谢解答 2012-12-09 15:05:44
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质粒是单酶切还是双酶切？ 如果是单酶切必须去磷酸化处理防止自连。 如果是双酶切，T4这一套是否有效，别人是否用过，因为buffer里含ATP，若buffer失效也会导致连接失败。 另外，也可能是PCR的问题，是否做了阳性和阴性对照。 |
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2楼2012-12-04 10:52:16
gyesang
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3楼2012-12-04 11:29:36
xj0311
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4楼2012-12-04 13:37:40