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wwm2008505

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
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7楼: Originally posted by huoyongting at 2012-12-04 17:13:48
才34bp,你直接用PCR的方法,把目的片段加在引物上,PCR扩增整个质粒,成功率非常高的,我前几天还做了一次,测序正确

目的片段加在引物上?这个我不是很懂。求助
11楼2012-12-09 15:12:16
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金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
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8楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-12-04 21:49:11
LS很对哈,你才34bp那么小的片段不需要做连接加上的,直接把目的序列加在引物上,做PCR连上就好了,你这样太麻烦了呢

直接把目的序列加在引物上?求解答。我这个不懂。非常感谢。。
12楼2012-12-09 15:16:55
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wwm2008505

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ls1988121 at 2012-12-04 10:52:16
质粒是单酶切还是双酶切?
如果是单酶切必须去磷酸化处理防止自连。
如果是双酶切,T4这一套是否有效,别人是否用过,因为buffer里含ATP,若buffer失效也会导致连接失败。
另外,也可能是PCR的问题,是否做了阳性 ...

质粒13k双酶切之后剩下11k。T4连接酶换了几种了。呜呜。
13楼2012-12-09 15:39:43
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2楼: Originally posted by ls1988121 at 2012-12-04 10:52:16
质粒是单酶切还是双酶切?
如果是单酶切必须去磷酸化处理防止自连。
如果是双酶切,T4这一套是否有效,别人是否用过,因为buffer里含ATP,若buffer失效也会导致连接失败。
另外,也可能是PCR的问题,是否做了阳性 ...

谢谢啦。做出来了。是没有连接上。我把载体和片段都加大了、可以了。
14楼2013-01-08 11:18:59
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