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我用的是pMAL-m2载体，片段大小连不上！
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我的片段大小是2000bp左右， 用的是Hind III和BamH I两个酶切位点，双酶切回收都有我的目的条带！ 我涂的板子是LB+Amp+Kan 用的连接酶是T4 DNA连接酶！ 长了一夜，没迹象！ 连接到这个载体上转化DH5是不是都长得慢些？ |
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yabxxh
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2楼2011-04-28 10:12:42
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【答案】应助回帖
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reasonspare(金币+2, EPI+1): 谢谢分享 2011-04-28 11:16:49
ltakashi(金币+1): 2011-06-02 20:49:49
reasonspare(金币+2, EPI+1): 谢谢分享 2011-04-28 11:16:49
ltakashi(金币+1): 2011-06-02 20:49:49
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1:首先长的慢是正常的，你这是双抗，但是如果超过24h，基本就没有连接上可能了。。2：不知道你有没有筛选标记呢?比如说蓝白斑？ 3：其实连接这个东东跟很多因素都是有关系的： 3.1：首先是你的质粒双酶切是否彻底，是否切的干净，你的基因也是不是双酶切得彻底？ 3.2:连接体系的问题，一般呢，我们是10ul体系，基因要比载体多一些，这个你要跑胶定量的。。。还有连接时间的问题，过夜连接，10---14h都可以； 3.3：你的感受态细胞活性如何？一般转DH5呢，应该没有什么问题。 3.4：培养基抗生素呢？浓度是否合适？ 如果做了几次都没有什么结果，那么换体系，换条件。。。。 BLESS |
3楼2011-04-28 10:45:01
yabxxh
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